核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)障礙在肌萎縮側(cè)索硬化-額顳癡呆發(fā)病機(jī)制中的研究進(jìn)展

中國人民解放軍總醫(yī)院海南分院神經(jīng)內(nèi)科，海南 三亞 572013

肌萎縮側(cè)索硬化（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）和額顳癡呆（frontotemporal dementia，F(xiàn)TD）是2種漸進(jìn)性且致命的神經(jīng)退行性疾病，目前臨床上尚無有效的治療方法。ALS的特征性病理表現(xiàn)為上下運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元退變，臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性肌肉萎縮、痙攣，構(gòu)音不清，吞咽和呼吸困難。FTD是一種發(fā)病率僅次于阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）的原發(fā)性退行性癡呆，約占老年前期癡呆的20%[1]，其特征性病理表現(xiàn)為大腦額顳葉萎縮，臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性人格和行為改變、認(rèn)知障礙和記憶減退。部分ALS患者同時(shí)伴有FTD，臨床表現(xiàn)為隨意肌麻痹以及認(rèn)知、執(zhí)行和語言功能損害。越來越多的證據(jù)表明[2-3]，ALS和FTD的臨床表現(xiàn)、病理特征和遺傳特征有所重疊。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，約15%的FTD患者合并ALS，22%～48%的ALS患者合并FTD[4]。ALS-FTD主要表現(xiàn)為2種臨床癥候群：一是ALS/運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元?。╩otor neuron disease，MND）癥候群，主要表現(xiàn)為中老年起病的進(jìn)行性肌無力和肌萎縮，尤以球部癥狀起病多見，下運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元損害癥狀大多較上運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元損害癥狀明顯；二是FTD癥候群，主要表現(xiàn)為精神行為異常、性格改變、非流利性失語、記憶障礙等。這2種臨床癥候群可同時(shí)出現(xiàn)或先后出現(xiàn)。FTD患者在合并ALS后，其平均生存期從8.2年縮短至2.4年[5]。

ALS-FTD的發(fā)病機(jī)制與基因、環(huán)境和老化等因素的相互作用有關(guān)。既往研究認(rèn)為，ALS與FTD屬于同一類蛋白病，其共同的發(fā)病機(jī)制主要為蛋白質(zhì)的錯(cuò)誤折疊。2006年以來的研究發(fā)現(xiàn)，反式激活應(yīng)答DNA結(jié)合蛋白43（transactive response DNA binding protein 43 kDa，TDP-43）免疫反應(yīng)陽性包涵體的形成是ALS和FTD的主要病理標(biāo)志[6-8]。反式激活應(yīng)答DNA結(jié)合蛋白（transactive response DNA binding protein，TARDBP）基因突變以及磷酸化、泛素化和N末端截短等修飾過程可引起病理性TDP-43蛋白。盡管僅在4%的家族性ALS患者和極少數(shù)FTD患者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)存在TARDBP基因突變，但在約97%的ALS患者和約45%的FTD患者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)TDP-43陽性包涵體[9-12]。由于TDP-43蛋白表達(dá)受核定位信號（nuclear localization signal，NLS）和轉(zhuǎn)移信號等調(diào)控，并且容易受到機(jī)體生理狀態(tài)的影響，因此在疾病和應(yīng)激狀態(tài)下，TDP-43蛋白可發(fā)生一系列病理學(xué)變化，受影響的神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的TDP-43蛋白失去其正常的細(xì)胞核定位，而以包涵體的形式出現(xiàn)在細(xì)胞質(zhì)中，從而引起神經(jīng)元進(jìn)行性變性，導(dǎo)致疾病的發(fā)生。一方面，病理性TDP-43蛋白發(fā)生了核質(zhì)分布異常[13-14]，此異?？赡軙?dǎo)致TDP-43蛋白毒性的獲得和生理功能的喪失；另一方面，以TDP-43蛋白為代表的RNA結(jié)合蛋白還可以通過多種作用機(jī)制遏制正常的核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)，這也是與ALS-FTD發(fā)病最為相關(guān)的致病基因——第9號染色體開放閱讀框72（chromosome 9 open reading frame 72，C9ORF72）基因突變致病環(huán)節(jié)中的關(guān)鍵因素。那么，核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)障礙是否為導(dǎo)致TDP-43蛋白核質(zhì)分布異常的始動(dòng)因素呢？本文旨在對核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)障礙在ALS-FTD發(fā)病機(jī)制中的最新進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 RNA結(jié)合蛋白是ALS-FTD疾病發(fā)生發(fā)展中的核心蛋白

2015年以來，陸續(xù)有研究報(bào)道了53種參與ALS或FTD包涵體形成的錯(cuò)誤調(diào)節(jié)蛋白[15-19]，其中RNA結(jié)合蛋白占50%以上[20]。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，除TDP-43蛋白以外，其他RNA結(jié)合蛋白，如肉瘤融合（fused in sarcoma，F(xiàn)US）蛋白、TATA結(jié)合蛋白相關(guān)因子2N、EWS RNA結(jié)合蛋白 1（EWS RNA-binding protein 1，EWSR1）、基質(zhì)蛋白3、異質(zhì)性胞核核糖核蛋白A1和A2B1等，均存在一個(gè)朊蛋白樣結(jié)構(gòu)域（prion-like domain，PrLD），而ALS-FTD的致病突變位點(diǎn)均發(fā)生在PrLD拉鏈結(jié)構(gòu)中的關(guān)鍵保守序列[21-22]。該位點(diǎn)發(fā)生突變將阻礙RNA結(jié)合蛋白的正常核質(zhì)穿梭平衡，使其在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)積聚。FUS主要通過C3’末端的NLS介導(dǎo)核內(nèi)輸入。如果該位點(diǎn)發(fā)生突變，也可能阻礙轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白介導(dǎo)的核內(nèi)輸入或直接影響其與運(yùn)輸因子的結(jié)合，導(dǎo)致FUS蛋白滯留在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)[23]。除此之外，F(xiàn)US蛋白的亞細(xì)胞定位還受甲基化水平的調(diào)控[24]。誘導(dǎo)甲基化可促進(jìn)FUS蛋白在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)富集，而抑制甲基化則可引起核內(nèi)FUS蛋白的分布顯著增加。

2 基因突變是導(dǎo)致RNA結(jié)合蛋白發(fā)生核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)障礙的重要因素

C9ORF72基因是目前已知與ALS-FTD發(fā)病最為相關(guān)的致病基因[25-26]。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，5%～7%的歐洲和北美洲散發(fā)性ALS或FTD患者的發(fā)病與C9ORF72基因相關(guān)；在家族性ALS或FTD中，與C9ORF72基因相關(guān)的發(fā)病所占比例更高，約40%的家族性ALS患者和20%的家族性FTD患者攜帶C9ORF72突變基因；C9ORF72突變基因的非編碼區(qū)存在大量的GGGGCC六核苷酸重復(fù)擴(kuò)增序列，其長度與ALS和FTD的嚴(yán)重程度和發(fā)病年齡相關(guān)[27]。這些非編碼重復(fù)擴(kuò)增序列通過轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生重復(fù)RNA，這些非編碼RNA繼而通過富集大量的RNA結(jié)合蛋白，導(dǎo)致RNA結(jié)合蛋白介導(dǎo)的RNA正常代謝功能發(fā)生紊亂，包括特異性轉(zhuǎn)錄子的合成丟失和RNA剪接異常。

除了通過干擾細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)的代謝以發(fā)揮其毒性作用以外，含有突變序列的RNA在細(xì)胞核內(nèi)形成RNA團(tuán)簇（foci），后者通過非ATG依賴方式翻譯得到5種二肽重復(fù)蛋白（dipeptide repeat protein，DPR）[28]，其中有2種含精氨酸的DPR經(jīng)酵母模型和果蠅模型實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)存在生物學(xué)毒性[29]。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，一方面，含精氨酸的DPR通過模仿RNA結(jié)合蛋白的NLS，劫持細(xì)胞核輸入，導(dǎo)致RNA結(jié)合蛋白在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)集聚；另一方面，這些含精氨酸的DPR通過與RNA結(jié)合蛋白以及許多無膜細(xì)胞器組分之間相互作用，干擾正常的液－液相分離以及無膜細(xì)胞器的裝配和解聚過程，誘導(dǎo)無膜細(xì)胞器失能，并聚集形成淀粉樣纖維，從而誘發(fā)神經(jīng)退行性疾病。在果蠅模型中，來源于C9ORF72突變基因過表達(dá)患者皮質(zhì)神經(jīng)元的GGGGCC重復(fù)序列，可導(dǎo)致果蠅復(fù)眼形態(tài)發(fā)生進(jìn)行性的破壞，果蠅運(yùn)動(dòng)活力也明顯降低；而RanGTP酶激活蛋白（Ran GTPaseactivating protein，RanGAP）過表達(dá)可抑制重復(fù)序列誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性，逆轉(zhuǎn)果蠅復(fù)眼神經(jīng)和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)的退行性變[30]。RanGAP在細(xì)胞質(zhì)中可誘導(dǎo)RanGTP酶將GTP水解成GDP，從而確保高效的核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)過程。因此，C9ORF72基因重復(fù)擴(kuò)增序列突變不僅干擾了神經(jīng)元內(nèi)RanGAP的正常功能，還通過抑制核內(nèi)輸入過程，導(dǎo)致RanGAP蛋白錯(cuò)誤定位以及在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)異常聚集。

3 核孔失能和核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)缺陷是ALS-FTD發(fā)病的關(guān)鍵

ALS-FTD是一種成年起病且呈慢性進(jìn)展的神經(jīng)退行性疾病，其核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)體的轉(zhuǎn)運(yùn)效率和選擇性隨著年齡的增長而顯著下降，在有絲分裂過程中發(fā)生周期性消失和重建的核膜，其核孔的滲透性修復(fù)功能也日益削弱[31]。尸檢發(fā)現(xiàn)，ALS-FTD患者體內(nèi)的多種核轉(zhuǎn)運(yùn)因子存在錯(cuò)誤定位和異常聚集[32]。一方面，蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)缺陷可能是重要的影響因素之一，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)集聚的淀粉樣蛋白及疾病相關(guān)蛋白如TDP-43蛋白片段可干擾核孔亞基及核轉(zhuǎn)運(yùn)因子的正常功能以及核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的溶解性，導(dǎo)致核輸入轉(zhuǎn)運(yùn)缺陷[33]；另一方面，RNA代謝異常也是ALS-FTD病理機(jī)制中的重要環(huán)節(jié)。體外細(xì)胞系研究發(fā)現(xiàn)，條件性敲除TDP-43基因可導(dǎo)致多種細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)因子的缺失或異常定位[34]。FTD小鼠模型研究發(fā)現(xiàn)，TDP-43蛋白發(fā)生異常的亞細(xì)胞定位可導(dǎo)致RanGTP酶缺失，且TDP-43蛋白功能缺失可導(dǎo)致Ran蛋白表達(dá)減少，而過表達(dá)Ran蛋白可逆轉(zhuǎn)神經(jīng)退行性變和小鼠皮質(zhì)神經(jīng)元TDP-43蛋白的錯(cuò)誤定位。因此，筆者推測Ran蛋白可能成為潛在的逆轉(zhuǎn)C9ORF72基因突變和TDP-43蛋白功能缺失所導(dǎo)致的神經(jīng)退行性疾病的關(guān)鍵治療靶點(diǎn)。

4 探索核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)在ALS-FTD發(fā)病機(jī)制研究中的意義

ALS-FTD并非單基因疾病，目前有關(guān)核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的遺傳學(xué)研究較少。一項(xiàng)動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Gle1 RNA核輸出介導(dǎo)因子在ALS-FTD發(fā)病中具有重要作用，敲除Gle1基因可誘導(dǎo)胚胎斑馬魚出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元發(fā)育缺陷，而過表達(dá)野生型Gle1基因則可逆轉(zhuǎn)此過程[35]。

目前有關(guān)ALS-FTD究竟是腦疾病還是周圍神經(jīng)病變，仍存在較多爭議。2017年發(fā)表的一項(xiàng)研究支持ALS-FTD屬于原發(fā)性新皮質(zhì)疾病，并在散發(fā)性ALS患者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了TDP-43蛋白包涵體的特定擴(kuò)散徑路；隨著病程的進(jìn)展，新皮質(zhì)神經(jīng)元內(nèi)含有的毒性TDP-43蛋白通過軸突、突觸或直接接觸進(jìn)行擴(kuò)散，順向傳遞至腦干和脊髓前角細(xì)胞，并從可溶性轉(zhuǎn)變?yōu)椴豢扇苄裕^而引起下游神經(jīng)元內(nèi)正常核蛋白功能缺失[36]。然而，目前尚未明確新皮質(zhì)內(nèi)抑制細(xì)胞質(zhì)內(nèi)TDP-43包涵體集聚的機(jī)制。

5 小 結(jié)

自從發(fā)現(xiàn)TDP-43蛋白是ALS和FTD包涵體的主要組分后，人們對于這種RNA結(jié)合蛋白的了解日益深入。一系列研究已揭示TDP-43蛋白存在異常的細(xì)胞質(zhì)定位。生理狀態(tài)下，TDP-43蛋白在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)合成，繼而轉(zhuǎn)變?yōu)榉€(wěn)定的多肽；大部分的成熟TDP-43蛋白被轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核內(nèi)，通過與反式激活應(yīng)答DNA結(jié)合，發(fā)揮調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的作用，并參與mRNA的修飾。由此推測，核膜轉(zhuǎn)運(yùn)缺陷即TDP-43蛋白核內(nèi)轉(zhuǎn)入缺陷導(dǎo)致的TDP-43蛋白正常功能丟失及獲得性神經(jīng)毒性可能是ALSFTD發(fā)病的始動(dòng)因素之一。盡管如此，這些病理性TDP-43蛋白的產(chǎn)生及獲得性神經(jīng)毒性的機(jī)制，仍有待進(jìn)一步研究。

本課題組的前期工作主要是致力于探索和發(fā)現(xiàn)與ALS病變關(guān)鍵特征相關(guān)的潛在生物學(xué)標(biāo)志物，通過結(jié)合神經(jīng)病理變化予以驗(yàn)證。今后，需要進(jìn)一步探索并闡明ALS-FTD發(fā)病中TDP-43蛋白免疫反應(yīng)陽性包涵體形成的具體過程及其機(jī)制。

致謝

衷心感謝中國人民解放軍總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科沈定國教授（兼中華醫(yī)學(xué)會神經(jīng)病學(xué)分會神經(jīng)肌肉病學(xué)組組長）在本文寫作過程中給予作者的指導(dǎo)。