酵母培養(yǎng)物添加方式對哺乳期犢牛生長性能、糞便菌群及血清免疫指標的影響

徐曉鋒， 金亞東， 張力莉， 王 芬， 張珠明

（1.寧夏大學農學院，寧夏銀川 750021；2.北京英惠爾生物科技有限公司，北京海淀 100083）

有研究發(fā)現(xiàn)，給反芻動物飼喂酵母培養(yǎng)物會降低其糞便中大腸桿菌的數(shù)量，增加有益菌群的數(shù)量，并且越早的飼喂動物酵母培養(yǎng)物，越有利于酵母培養(yǎng)物作用的發(fā)揮 （Swyers等2014）。另外，研究表明，飼喂酵母培養(yǎng)物能夠提高動物的采食量，增強機體免疫力等（Gerritsen等，2012）。本文旨在研究酵母培養(yǎng)物不同添加方式對犢牛生長性能、糞便菌群以及機體免疫力的影響，從而為實際生產養(yǎng)殖提供理論依據(jù)，以期通過營養(yǎng)調控與飼養(yǎng)管理來實現(xiàn)對哺乳期犢牛以及后備牛培育質量的提升。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與設計 本試驗于2015年9～11月份，在寧夏平吉堡奶牛場進行。采用單因素試驗設計，按出生日齡、體重相近原則選擇28頭健康狀況良好的荷斯坦公犢牛，隨機分為4組，每組7個重復，Ⅰ組為對照組，飲用乳及日糧中均不添加酵母培養(yǎng)物；Ⅱ組在飲用乳中添加20 g酵母培養(yǎng)物，日糧中不添加酵母培養(yǎng)物；Ⅲ組在日糧中添加20 g酵母培養(yǎng)物，飲用乳中不添加酵母培養(yǎng)物；Ⅳ組在飲用乳和日糧中各添加10 g酵母培養(yǎng)物。

酵母培養(yǎng)物由北京英惠爾生物科技股份有限公司提供。

1.2 飼養(yǎng)管理 犢牛出生后及時清除全身黏液，并對其進行斷臍和臍帶藥浴消毒。在犢牛出生2 h內，按其體重的8%飼喂初乳。待其可以站立后，將其移入1.5×3.0 m2犢牛島內。每天分兩次飼喂混合牛乳，分別為早上7:00和下午6:00。各組犢牛的牛乳飼喂量一致，1周齡4 kg/d·頭；2周齡 5 kg/d·頭；3周齡 6 kg/d·頭；4 ～ 8周齡 7 kg/d·頭。開食料及飲水任其自由采食。試驗于第7天正式開始，整個試驗周期為56 d，整個試驗期內定期對犢牛島進行消毒處理。開食料組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 開食料組成及營養(yǎng)水平（風干基礎）

1.3 測定指標和方法

1.3.1 生長性能統(tǒng)計 分別于試驗第0、21、42、56天晨飼前測定各組犢牛的體重；同時在當天測定每頭犢牛的胸圍、體斜長和體高，用以計算體軀指數(shù)和體長指數(shù)，計算公式如下：

體長指數(shù)/%=體斜長/體高×100；體軀指數(shù)/%=胸圍/體斜長×100。

每天統(tǒng)計每頭牛的采食量；并分別記錄各組犢牛腹瀉頭數(shù)以及腹瀉天數(shù)，用以計算每組犢牛的腹瀉指數(shù)，計算公式如下：

腹瀉指數(shù)=（腹瀉頭數(shù)×腹瀉天數(shù)）/（試驗天數(shù)×試驗頭數(shù)）。

1.3.2 直腸大腸桿菌和雙歧桿菌數(shù)量的測定在犢牛21日齡和56日齡，分別從每組選取3頭犢牛，用無菌塑料小勺從犢牛直腸內取其糞便，裝入無菌試管中，并立即封口，在30 min內帶回實驗室進行檢測。在無菌操作環(huán)境內，分別取糞樣1 g，裝入盛有9 mL生理鹽水的無菌稀釋管中，在漩渦振蕩器上振蕩2～3 min，將其配制成1∶10的勻漿稀釋液；用移液槍取該勻漿液1 mL加入盛有9 mL生理鹽水的稀釋管內，用漩渦振蕩器振蕩1～2 min，配制成10-2的稀釋液，再按照上述方法配制10-3～10-5的稀釋液備用。

選取適宜的稀釋度，分別涂布在伊紅美藍選擇性培養(yǎng) （EMB）和雙歧桿菌選擇性培養(yǎng)基（BBL）表面（兩種培養(yǎng)基均購自青島高科園海博生物技術有限公司），每個梯度做3個平行。將接種過的大腸桿菌培養(yǎng)皿倒置放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中，在有氧環(huán)境下培養(yǎng)24 h；雙歧桿菌采用李伏夫法，在37℃恒溫培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)72 h。以1 g腸道內容物中細菌個數(shù)的對數(shù) （lg cfu/g）來表示糞便中細菌數(shù)量。

1.3.3 血清樣品采集與指標測定 分別與試驗的第21天以及第56天晨飼前用含肝素鈉的真空采血管頸靜脈采血5 mL，室溫下靜置30 min，然后3000 r/min離心15 min，取血清裝入1.5 mL的凍存管中，-20℃下保存?zhèn)錅y血清中IgA、IgG、IgM、IL-1β和TNF-α的濃度。血清中各免疫指標濃度的測定，均采用牛免疫球蛋白雙抗一步夾心ELISA法，并嚴格按照試劑盒說明書上的操作步驟進行規(guī)范操作，所有試劑盒均夠自南京建成生物工程研究所。

1.4 統(tǒng)計分析 用Excel 2007對數(shù)據(jù)進行基本的分類統(tǒng)計，然后用SAS 8.0軟件對數(shù)據(jù)進行深度分析。以P＜0.05作為差異顯著的判斷標準，結果以“平均值±標準差”來表示。

2 結果與分析

2.1 酵母培養(yǎng)物對犢牛生長性能的影響

2.1.1 酵母培養(yǎng)物對犢牛體尺指數(shù)的影響 由表2可知，在整個試驗周期內，犢牛體軀指數(shù)的組間差異不顯著（P＞0.05）；并且犢牛體軀指數(shù)的變化不受試驗天數(shù)的影響（P>0.05）。而犢牛體長指數(shù)則隨著試驗天數(shù)的延長而增加，天數(shù)對犢牛體長指數(shù)的增加有顯著的影響 （P＜0.05）；但各處理組間的體長指數(shù)差異不顯著（P>0.05）。試驗后期，試驗組的體長指數(shù)較對照組均有一定的增加，但差異不顯著（P>0.05）。表明添加酵母培養(yǎng)物對提高犢牛的體長指數(shù)有一定的作用。

表2 酵母培養(yǎng)物對犢牛體尺指數(shù)的影響

2.1.2 酵母培養(yǎng)物對犢牛采食量、日增重和飼料轉化效率的影響 由表3可知，在0～21 d這一階段，各試驗組ADMI量均高于對照組，但差異不顯著（P＞0.05）；而ADG除Ⅱ組高于Ⅰ組外，Ⅲ組和Ⅳ組均低于Ⅰ組，各處理組間差異不顯著（P＞0.05）；此階段的F/G則是以Ⅱ組為最低，Ⅰ組次之，各處理組間差異不顯著（P＞0.05）。在22～42 d這一階段，各試驗組ADMI和ADG均高于對照組，但差異不顯著（P＞0.05）；此階段的F/G則是以Ⅳ組為最低，Ⅱ組次之，各試驗組F/G均低于Ⅰ組，但差異不顯著（P＞0.05）。在43～56 d這一階段中，各試驗組ADMI均高于Ⅰ組，但差異不顯著（P＞0.05）；除Ⅳ組外，此階段各試驗組ADG均高于Ⅰ組，但差異不顯著（P＞0.05）；此階段，各試驗組F/G均低于Ⅰ組，各處理組間差異不顯著（P＞0.05）。在整個試驗周期內，各試驗組ADMI分別比對照組提高8.95%、15.19%和10.89%（P＞0.05）；各試驗組ADG分別比對照組提高24.83%、21.48%和19.46%（P＞0.05）， 各試驗組F/G分別比對照組降低12.00%、5.33%和8.00%（P ＞ 0.05）。

2.2 酵母培養(yǎng)物對犢牛糞便中細菌數(shù)量的影響由表4可知，在試驗第21天時，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組糞樣中的大腸桿菌的數(shù)量顯著低于Ⅰ組（P＜0.05），3個試驗組中大腸桿菌數(shù)以Ⅱ組為最低，各試驗組大腸桿菌數(shù)無顯著差異（P＞0.05）；Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組糞樣中雙歧桿菌的數(shù)量顯著高于Ⅰ組 （P＜0.05），各試驗組雙岐桿菌數(shù)無顯著差異 （P＞0.05），但Ⅱ組的雙歧桿菌數(shù)在3個試驗組中為最高。在試驗第55天，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組糞樣中雙歧桿菌的數(shù)量略高于Ⅰ組，但無顯著差異 （P＞0.05）；而糞樣中大腸桿菌數(shù)則是Ⅰ組最高，且顯著高于試驗Ⅱ組（P＜0.05），各試驗組間大腸桿菌數(shù)差異不顯著（P＞0.05）。整個試驗周期內，試驗組犢牛腹瀉指數(shù)分別比對照組降低88.89%、78.89%和83.33%。

表3 酵母培養(yǎng)物對犢牛平均日增重、采食量和料重比的影響

表4 酵母培養(yǎng)物對犢牛糞便微生物菌群的影響

2.3 酵母培養(yǎng)物對犢牛血清免疫指標的影響由表5可知，在試驗開始的第21天，各試驗組犢牛血清中IgA的濃度均高于Ⅰ組 （P＜0.05），且各試驗組間差異均不顯著（P＞0.05）;與Ⅰ組相比，試驗組IgA的濃度分別提高22.23%、10.12%、9.52%。血清中IgM的變化規(guī)律與IgA一致；與Ⅰ組相比，各試驗組IgM的濃度分別提高18.21%、9.59%、6.14%（P＜ 0.05）。在試驗的第21天，各試驗組犢牛血清中IgM的濃度均高于Ⅰ組，且Ⅱ組和Ⅳ組血清中IgM的濃度顯著高于Ⅰ組（P＜0.05），而Ⅲ組血清中IgM的濃度與Ⅰ組差異不顯著 （P＞0.05）；各試驗組血清中IgM的濃度分別比Ⅰ組提高21.05%、3.07%、9.81%。各試驗組血清中IL-1β的濃度均高于Ⅰ組，且差異顯著（P＜0.05）；Ⅱ組與Ⅲ組和Ⅳ組間差異不顯著（P＞0.05），但Ⅲ組和Ⅳ組間的差異顯著 （P＜0.05）；各試驗組分別比對照提高24.02%、32.90%、22.13%。各處理組間血清中TNF-α的濃度無顯著差異；各試驗組TNF-α濃度分別比Ⅰ組提高10.14%、15.31%、15.31%。

在試驗開始的第55天，各處理組血清中I-gA、IgM、IgG和IL-1β濃度之間的差異不顯著；且Ⅱ組和Ⅲ組IgA、IgM、IgG和IL-1β均高于Ⅰ組；而Ⅳ組除IgA濃度比Ⅰ組高外，其IgM和IgG濃度分別比Ⅰ組降低0.23%和3.05%。試驗組血清中TNF-α的濃度均低于Ⅰ組，各試驗組間差異不顯著（P＞0.05）；Ⅰ組與Ⅱ組和Ⅲ組間差異顯著 （P＜0.05）；與Ⅰ組相比，各試驗組TNF-α的濃度分別降低10.18%、9.92%、7.58%。

3 討論

3.1 酵母培養(yǎng)物對犢牛生長性能的影響 體軀指數(shù)是用來反映軀體容量的相對發(fā)育情況，而體長指數(shù)是用來反映體格長度和高度的相對發(fā)育情況。體長指數(shù)以及體軀指數(shù)主要受遺傳因素的影響，但后天管理水平對其也有一定程度的影響。犢牛體軀指數(shù)受外界影響較小，但體長指數(shù)則與后期的飼養(yǎng)管理之間有密切關系。如果犢牛在生長發(fā)育期的管理水平過低，就會造成犢牛生長發(fā)育不完全，其體長指數(shù)就會低于同期牛群體長指數(shù)的平均值。犢牛在哺乳早期時，其身體發(fā)育的重點是骨骼，中期則為體長。本試驗發(fā)現(xiàn)，添加酵母培養(yǎng)物提高了犢牛的ADMI及飼料轉化效率，相對的提高了犢牛的營養(yǎng)水平，滿足了自身生長發(fā)育對營養(yǎng)物質的需要，從而促進了其體尺的發(fā)育。

眾多研究表明，飼喂動物酵母培養(yǎng)物可以提高動物的ADMI、F/G以及ADG。Tripathi研究發(fā)現(xiàn)，添加酵母培養(yǎng)物可以提高羔羊的日采食量（Tripathi等，2010）；耿春銀（2015）認為，添加酵母培養(yǎng)的并非增加了犢牛采食量本身，而是增加了犢牛的采食次數(shù)（耿春銀等，2015）。因為添加酵母培養(yǎng)物會縮短犢牛的采食間隔，其采食頻率有一定程度的增加。本研究結果表明，添加酵母培養(yǎng)對犢牛飼料轉化率產生了積極影響。添加酵母培養(yǎng)物可以增加瘤胃揮發(fā)酸的濃度（Santos等，2015），而揮發(fā)酸中的乙酸和丁酸可以促進瘤網胃的發(fā)育（Mentschel等，2001），進而增加犢牛對營養(yǎng)物質的消化吸收。另外，本研究發(fā)現(xiàn)，添加酵母培養(yǎng)物組的犢牛腹瀉發(fā)生率低于Ⅰ組，這就減少了犢牛因為腹瀉而造成的營養(yǎng)損失，相對增加了犢牛飼料的轉化效率；而犢牛腹瀉率的降低，則相對提高了犢牛的采食欲望，從而增加了犢牛的ADMI。犢牛ADG的提高，則是其采食量以及飼料轉化效率都提高的必然結果。

表5 酵母培養(yǎng)物對犢牛血清免疫指標的影響

3.2 酵母培養(yǎng)物對犢牛糞便菌群個數(shù)的影響犢牛在哺乳早期，由于自身免疫力低下，加上飲用牛乳由初乳過渡到常乳，還有外界的各種應激環(huán)境，極易造成犢牛腸道菌群的紊亂，進而導致腹瀉的發(fā)生。而引起犢牛腹瀉的常見致病菌為大腸桿菌。研究表明，酵母培養(yǎng)物能促進動物腸道有益菌群的增殖，并降低致病菌的數(shù)量（Magalhaes 等，2008），從而減小動物腹瀉發(fā)生的幾率。而酵母培養(yǎng)物作用的發(fā)揮，則主要依賴于其細胞壁中的甘露寡糖和β-葡聚糖兩種成分（Jensen 等，2008；Fonty 等，2006）。 研究發(fā)現(xiàn)，酵母細胞壁以及其中所含的甘露寡糖對外源致病菌有一定的吸附作用（Perez-Sotelo等，2005），酵母培養(yǎng)物通過甘露寡糖實現(xiàn)對致病菌的特異性結合（White等，2002），競爭性的抑制病原菌在腸道的定植（Daudelin等，2011），并降低腸道pH，避免致病菌通過腸道進入機體從而誘發(fā)腹瀉；同時酵母培養(yǎng)物中的甘露寡糖和β-葡聚糖，還可作為腸道有益菌群如乳酸桿菌和雙岐桿菌的營養(yǎng)物質，從而促進腸道有益菌的增長，相對的降低大腸桿菌等致病菌群的數(shù)量。

本研究發(fā)現(xiàn)，飼喂犢牛酵母培養(yǎng)物可降低犢牛腹瀉發(fā)生率，并且哺乳早期在牛奶中添加酵母培養(yǎng)對糞便菌群的影響優(yōu)于其他兩種添加方案。Ⅱ組對糞中雙岐桿菌的數(shù)量增高百分數(shù)，分別比Ⅲ組和Ⅳ組高 1.3%、1.4%（P＜0.05）；而對糞中大腸桿菌的降低百分數(shù)分別比Ⅲ組和Ⅳ組高2.2%、1.1%。其原因可能是，在牛奶中添加酵母培養(yǎng)物增加了酵母培養(yǎng)物與瘤胃壁的接觸面積，從而增強了酵母培養(yǎng)物作用的發(fā)揮，進而促進了瘤胃微生物區(qū)系的建立，增加了瘤胃的消化能力，同時優(yōu)化了后端腸道的菌群。

3.3 酵母培養(yǎng)物對犢牛血清免疫物質含量的影響 犢牛出生后，其機體免疫獲得方式轉變?yōu)楸粍荧@得。在其機體免疫系統(tǒng)建立之前，犢牛主要從母乳中獲得所需的免疫球蛋白（Godden等，2008）。研究表明，在犢牛出生后如能飲用經過加熱處理的初乳，對降低其腹瀉發(fā)生率具有一定的作用 （Godden等，2015；Nilusha等，2015）。初乳中所含免疫球蛋白主要為IgA、IgM和IgG。其中IgG為乳中主要的免疫球蛋白，能預防全身和腸道的感染；IgA對機體的黏膜免疫具有顯著作用；IgM則可預防3日齡以前出生犢牛的敗血癥。研究表明，免疫球蛋白在初乳蛋白質中占到23%，而在常乳中僅占3%左右。所以如果犢牛能夠長期得到足量的初乳，其腹瀉發(fā)生率會顯著降低。然而在當今的規(guī)?；B(yǎng)殖下，犢牛無法長期的從初乳中獲得足夠的免疫球蛋白，且其血清中的母源抗體量會隨著日齡的增加而逐漸的降低，而犢牛哺乳前期是其腹瀉的高發(fā)期。所以為降低犢牛腹瀉發(fā)生率，提高其成活率，人為的提高犢牛血清免疫球蛋白的濃度就顯得極為重要。本研究顯示，飼喂犢牛酵母培養(yǎng)物能夠提高犢牛血清免疫球蛋白的含量，且在犢牛飲用奶中添加酵母培養(yǎng)物效果更加顯著。Kim等（2011）研究表明，飼喂犢牛酵母培養(yǎng)物能改善機體健康狀況，提高血清免疫球蛋白的濃度。黏膜免疫系統(tǒng)是機體的第一道免疫防線，其可以將外來致病菌在侵入機體組織之前被消滅，從而避免機體組織受損。而Yuan等（2015）的研究則證實，添加酵母培養(yǎng)物可以提高機體IgA含量，增強機體黏膜免疫應答能力。

IL-1β主要為巨噬細胞分泌的細胞因子，其含量的高低可以作為評判機體非特異性免疫的指標。TNF-α是由激活的巨噬細胞產生的一種內源性細胞因子，其含量的高低可反映肝損傷的程度。IL-1β的過度分泌可刺激機體產生更多的TNF-α，從而引起細胞損傷。在本試驗開始后的第21天，各試驗組IL-1β的濃度顯著高于Ⅰ組；各處理組血清中TNF-α的濃度差異不顯著，且Ⅱ組血清中TNF-α的濃度為3個試驗組中最低。這說明添加酵母培養(yǎng)物提高了犢牛的非特異性免疫，且沒有對其造成損傷，并且在牛奶中添加酵母培養(yǎng)物的方案優(yōu)于其他兩種添加方案。這一作用在試驗開始后的第56天再次得到驗證。在試驗的第56天，各處理組血清中IL-1β的濃度無顯著差異，且試驗組高于Ⅰ組；而試驗組血清中TNF-α的濃度則顯著低于Ⅰ組，且Ⅱ組血清中TNF-α的濃度最低。

4 結論

本試驗結果表明，在犢牛飲用奶、開食料或飲用奶和開食料中添加酵母培養(yǎng)物，均對犢牛生長性能、腸道健康以及機體免疫具有促進作用；但綜合比較則發(fā)現(xiàn)，在牛奶中添加酵母培養(yǎng)物要優(yōu)于其他兩種添加方式。

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