伏隔核區(qū)Jak/Stat3抑制劑注射調(diào)控布氏田鼠的能量代謝

閆立新， 張知彬， 宋銘晶*

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100021； 2.中國科學(xué)院動(dòng)物研究所，北京100101)

瘦素主要由白色脂肪細(xì)胞分泌，它有助于減少脂肪積累、降低體質(zhì)量、增強(qiáng)能量代謝。瘦素缺乏或瘦素抵抗是導(dǎo)致肥胖的重要發(fā)病機(jī)制之一。迄今為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)瘦素有8種突變方式，突變的瘦素蛋白不能和瘦素受體結(jié)合，無法發(fā)揮減少攝食和降低體質(zhì)量的作用，最終導(dǎo)致極度肥胖(Strobeletal.，1998；Chekhranovaetal.，2008；Mazenetal.，2009；Fischer-Posovszkyetal.，2010；Fatimaetal.，2011；Thakuretal.，2014；Wabitschetal.，2015)。最近發(fā)現(xiàn)的瘦素的一種突變是在2015年，研究者發(fā)現(xiàn)一個(gè)2歲小男孩出現(xiàn)了早發(fā)性極端肥胖，原因是其瘦素的第100個(gè)氨基酸由天冬氨酸突變?yōu)槔野彼?，瘦素失去了生物學(xué)活性，在使用人重組瘦素(美曲普汀)治療后，病人的飲食行為恢復(fù)正常，且體質(zhì)量迅速下降(Wabitschetal.，2015)。瘦素是下丘腦發(fā)育過程中的神經(jīng)營養(yǎng)因子，促進(jìn)下丘腦瘦素傳導(dǎo)到大腦腦區(qū)通路的形成，從而達(dá)到控制腦區(qū)、調(diào)控飲食與能量消耗的功能(Bouretetal.，2004)。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription，Stat3)作為轉(zhuǎn)錄因子可以通過調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄來控制細(xì)胞增殖、生長、凋亡等過程，進(jìn)而參與到免疫、腫瘤生成、肥胖等生命進(jìn)程中。瘦素通過誘導(dǎo)Stat3的磷酸化調(diào)控中樞神經(jīng)系統(tǒng)，從而達(dá)到抑制肥胖的功能(Pattersonetal.，2009)。研究發(fā)現(xiàn)，高脂飲食肥胖小鼠的leptin-Stat3(瘦素-Stat3)信號(hào)通路幾乎被抑制，磷酸化Stat3(P-Stat3)的表達(dá)量明顯下降，但經(jīng)過12周自主轉(zhuǎn)輪運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)后，高脂飲食肥胖小鼠的leptin-Stat3信號(hào)通路恢復(fù)，P-Stat3表達(dá)量提高，進(jìn)而減少高脂飲食對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響(Laingetal.，2016)。

布氏田鼠Lasiopodomysbrandtii是研究“健康性肥胖”的潛在模型動(dòng)物，雖然長光照在35 d后會(huì)導(dǎo)致布氏田鼠體質(zhì)量在短時(shí)間顯著增加，但是它會(huì)重新建立一種穩(wěn)態(tài)，與短光照的布氏田鼠相比，長光照布氏田鼠白色脂肪的總含量顯著增高，血清瘦素含量顯著增高，飲食量顯著下降，沒有出現(xiàn)瘦素抵抗與胰島素抵抗的現(xiàn)象(Liuetal.，2016)。此外，在懷孕和哺乳期間給予布氏田鼠高蛋白飲食可以降低后代的消化能力，并降低其肥胖抵抗以及糖耐受現(xiàn)象(Louetal.，2015；Zhangetal.，2017)。因此，我們認(rèn)為布氏田鼠在研究肥胖與代謝方面具有很高的潛在應(yīng)用價(jià)值。迄今為止，沒有大腦伏隔核區(qū)與代謝類疾病相關(guān)的報(bào)道，而且瘦素在伏隔核區(qū)高表達(dá)，因此選擇伏隔核作為本實(shí)驗(yàn)代謝研究的腦區(qū)。通過在布氏田鼠伏隔核區(qū)定點(diǎn)注射Jak/Stat3抑制劑(WP1066)阻斷l(xiāng)eptin-Stat3信號(hào)通路，探索伏隔核區(qū)瘦素通路與能量代謝的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物50 g左右雄性布氏田鼠(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用批準(zhǔn)號(hào)：ILAS-PG-2014-011)共30只，并在獨(dú)立送排風(fēng)凈化動(dòng)物籠中飼養(yǎng)，照明晝夜節(jié)律為14∶10。動(dòng)物飲水、墊料和籠具均經(jīng)高壓滅菌處理，飼料經(jīng)Co60照射消毒達(dá)到SPF級(jí)動(dòng)物飼料標(biāo)準(zhǔn)。

1.1.2實(shí)驗(yàn)器材腦立體定位儀(Stoelting，USA)，腦區(qū)套管(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)，TSE動(dòng)物代謝測(cè)量分析系統(tǒng)-PhenoMaster/LabMaster(TSE Systems)。

1.1.3試劑Jak/Stat3抑制劑WP1066(Abcam)，二甲基亞砜(DMSO)，Western Blot用瘦素抗體(Abcam)，免疫組化用Phospho-Stat3(Tyr705)抗體(Cell Signaling)，山羊抗兔抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，麻醉劑(2.5%水合氯醛)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1腦區(qū)埋管手術(shù)用麻醉劑將布氏田鼠麻醉后固定在腦立體定位儀上，在頭部剪開1 cm左右露出頭蓋骨，并確定左右頭骨、前后囟在同一水平線上，根據(jù)伏隔核腦區(qū)坐標(biāo)(AP：1.6 mm，ML：±1.3 mm，DV：-4.3 mm)雙側(cè)埋管。手術(shù)后，給予正常飲食。1周后，待其體質(zhì)量恢復(fù)后進(jìn)行藥物注射。

1.2.2腦區(qū)注射對(duì)照組注射二甲基亞砜，實(shí)驗(yàn)組注射WP1066(10 mmol·L-1)，注射速度是每側(cè)1 μL/3 min，注射結(jié)束后留針2 min，防止液體倒流并使其充分?jǐn)U散。每隔一天注射1次藥物，共注射4次。

1.2.3動(dòng)物代謝測(cè)量分析實(shí)驗(yàn)先將布氏田鼠放入代謝籠適應(yīng)2 d，再收集其之后12 d的本底代謝水平，然后開始給布氏田鼠注射藥物，注射藥物結(jié)束4 h后收集接下來2 d的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1.2.4動(dòng)物體質(zhì)量在注射藥物之前稱量布氏田鼠的體質(zhì)量，再稱量其第10天的體質(zhì)量。

1.2.5WesternBlot實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，獲取布氏田鼠新鮮腦組織，冰凍切片摳取伏隔核腦區(qū)，將摳取的腦組織放在同一個(gè)離心管里，提取蛋白，-80 ℃儲(chǔ)存，Western Blot檢測(cè)瘦素的表達(dá)量。

1.2.6免疫組化實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，在布氏田鼠的心臟處灌流，先用生理鹽水沖洗，再用4%多聚甲醛灌注固定，最后將腦組織儲(chǔ)存在4%多聚甲醛中，冰凍切片厚40 μm，浸泡在10%疊氮化鈉中儲(chǔ)存，免疫組化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)P-Stat3表達(dá)量。

1.2.7血清瘦素濃度和血糖濃度測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)束后麻醉布氏田鼠，用1 mL注射器在其腹主動(dòng)脈抽取血樣放在血液促凝管中，離心得血清(3 500 r·min-1，10 min)，并檢測(cè)血清瘦素濃度(放射免疫，北京北方生物技術(shù)研究所有限公司)和血糖濃度(葡萄糖氧化法，北京北方生物技術(shù)研究所有限公司)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)使用SPSS 20.0，代謝籠數(shù)據(jù)(總飲水量、總能量消耗量、總耗氧量、呼吸交換率)用重復(fù)測(cè)量方差分析，其他數(shù)據(jù)用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)法分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SE)表示，最后用GraphPad Prism 6作圖。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 免疫組化檢測(cè)伏隔核區(qū)P-Stat3表達(dá)

免疫組化結(jié)果顯示，布氏田鼠伏隔核區(qū)P-Stat3(Tyr705)表達(dá)顯著下降(圖1)。

2.2 Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)伏隔核區(qū)瘦素表達(dá)

Western Blot結(jié)果顯示，布氏田鼠伏隔核區(qū)瘦素表達(dá)水平顯著下降(圖2)。

圖1 對(duì)照組(上)與實(shí)驗(yàn)組(下)伏隔核區(qū)P-Stat3的表達(dá)Fig. 1 Protein expression of P-Stat3 in nucleus accumbens of control group (upper) and experimental group (bottom)

aca. 伏隔核區(qū)的一部分，用于伏隔核的定位； 左下角為箭頭所指處的放大； 比例尺=200 μm

aca. the core of nudeus accumbens， which is used to locate nudeus accumbens in the brain； the small pictures in the lower-left are amplified area directed by the arrow in the same figure； scale bar=200 μm

圖2 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組伏隔核區(qū)的瘦素表達(dá)量
Fig. 2 Protein expression of leptin in control group and experimental group

**0.001

2.3 血清瘦素濃度與血糖濃度變化

實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組血清瘦素濃度之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，實(shí)驗(yàn)組n=9，對(duì)照組n=8；圖3)，血糖濃度差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，實(shí)驗(yàn)組n=7，對(duì)照組n=6；圖3)。

圖3 對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組血清瘦素濃度與血糖濃度比較Fig. 3 Comparison of serum leptin concentration and blood glucose level between control group and experimental group

2.4 代謝實(shí)驗(yàn)

與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組布氏田鼠總飲水量極顯著增加(P<0.01，實(shí)驗(yàn)組：n=6，對(duì)照組：n=6，時(shí)間=2 700 min；圖4：A)、總能量消耗量顯著下降(P<0.05，實(shí)驗(yàn)組：n=6，對(duì)照組：n=6，時(shí)間=2 700 min；圖4：B)、總耗氧量顯著下降(P<0.05，實(shí)驗(yàn)組：n=6，對(duì)照組：n=6，時(shí)間=2 700 min；圖4：C)、呼吸交換率(respiratory exchange rate， RER；RER=CO2產(chǎn)出量/O2消耗量)顯著提高(P<0.05，實(shí)驗(yàn)組：n=6，對(duì)照組：n=6，時(shí)間=1 800 min；圖4：D)、總自主運(yùn)動(dòng)量顯著下降(P<0.05，實(shí)驗(yàn)組：n=6，對(duì)照組：n=6，時(shí)間=2 700 min；圖4：E)、體質(zhì)量顯著增加(P<0.05，實(shí)驗(yàn)組：n=6，對(duì)照組：n=6，時(shí)間=10 d；圖4：F)。

圖4 對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的基礎(chǔ)代謝率比較
Fig.4 Comparison of basal metabolic rate between control group and experimental group

*0.01

3 討論

呼吸交換率是相同時(shí)間內(nèi)釋放CO2與吸收O2體積或摩爾數(shù)的比值，且有研究表明，O2消耗量也是影響體質(zhì)量與脂肪儲(chǔ)存的機(jī)制之一。研究發(fā)現(xiàn)，高呼吸交換率表明脂肪的高氧化率以及碳水化合物的低氧化率(Schutz，1995)；同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，呼吸交換率與體質(zhì)量的增加有關(guān)，呼吸交換率提高會(huì)導(dǎo)致體質(zhì)量增加(Haineretal.，2000；Marraetal.，2004)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組布氏田鼠的呼吸交換率顯著提高，說明實(shí)驗(yàn)組傾向于減少脂肪的消耗而增加糖的消耗，且實(shí)驗(yàn)組的能量消耗、活動(dòng)量以及耗氧量顯著下降，為脂肪積累創(chuàng)造了條件，最終導(dǎo)致肥胖。

在伏隔核區(qū)注射Jak/Stat3抑制劑后布氏田鼠體質(zhì)量顯著增加，而血糖與血清瘦素水平卻沒有顯著變化，從而驗(yàn)證了布氏田鼠可以作為研究“健康性肥胖”的模型動(dòng)物(Liuetal.，2016)。實(shí)驗(yàn)組布氏田鼠的飲水量顯著增加，由此可見，布氏田鼠是一種可應(yīng)用于研究代謝與飲食的潛在實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛣?dòng)物。

瘦素在控制能量代謝以及飲食功能上的重要性毋庸置疑，但是不同腦區(qū)瘦素水平的差異及其對(duì)代謝和神經(jīng)調(diào)控的影響還不確定。目前的研究結(jié)果顯示，瘦素抵抗主要分為外周性瘦素抵抗和中樞性瘦素抵抗。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，在布氏田鼠伏隔核區(qū)注射Jak/Stat3抑制劑后，P-Stat3表達(dá)量和瘦素水平顯著下降，而血清瘦素濃度卻無顯著變化，由此可見，使用抑制劑后只是導(dǎo)致中樞性瘦素抵抗，沒有造成外周性瘦素抵抗。造成中樞性瘦素抵抗的原因可能有2種：一是伏隔核區(qū)Jak/Stat3信號(hào)通路被抑制，導(dǎo)致leptin-Stat3信號(hào)通路傳導(dǎo)障礙，從而直接導(dǎo)致中樞性瘦素抵抗；二是伏隔核區(qū)Jak/Stat3信號(hào)通路被抑制后，間接降低血清瘦素的血腦屏障轉(zhuǎn)運(yùn)功能，從而降低腦組織中瘦素水平，最終導(dǎo)致中樞性瘦素抵抗(Banks，2001)。由此可見，leptin-Stat3信號(hào)通路被抑制會(huì)導(dǎo)致中樞性瘦素抵抗，調(diào)控布氏田鼠伏隔核區(qū)的leptin-Stat3信號(hào)通路能夠調(diào)控基礎(chǔ)代謝，進(jìn)而在短期內(nèi)改變其體質(zhì)量。需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明瘦素和P-Stat3調(diào)控下游通路的具體機(jī)制。

致謝：感謝孫秀萍老師對(duì)實(shí)驗(yàn)的指導(dǎo)，以及張楠師兄和田靜的幫助。

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