家雞似G蛋白偶聯受體119基因的克隆與組織表達分析

鄧秋洋， 張劍南， 王亞軍， 李娟

(四川大學生命科學學院，生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點實驗室，成都610065)

G蛋白偶聯受體(G protein-coupled receptor，GPCR)在真核生物中是最大、種類最多的細胞表面受體家族。人類基因組中參與編碼GPCR的基因超過1 000個，廣泛參與機體穩(wěn)態(tài)、胚胎發(fā)育以及學習、記憶、視覺、嗅覺和味覺調控等過程，其胞外配體包括離子和小分子等，如脂肪酸、氨基酸、多肽和類固醇等(Takedaetal.，2002；Perez，2003；Vassilatisetal.，2003；Fredriksson & Schi?th，2005)。鑒于GPCRs在機體內介導的廣泛生理效應，在制藥工業(yè)中，50%的藥物靶標設計針對GPCRs研發(fā)(Klabunde & Hessler，2002；Civelli，2005；Winzell & Ahrén，2007)。

G蛋白偶聯受體119(GPR119)是一類A型視紫紅質G蛋白偶聯受體(rhodopsin-like GPCR)，具典型7次跨膜結構，與胞內G蛋白偶聯，介導下游效應(Hansenetal.，2012)。目前，在大鼠Rattusnorvegicus、小鼠Musmusculus、倉鼠Mesocricetusauratus、黑猩猩Pantroglodytes、恒河猴Macacamulatta、牛Bostaurus和狗Canislupusfamiliaris等哺乳動物中，GPR119基因已獲得鑒定(Overtonetal.，2008)。在人Homosapiens、小鼠中，GPR119基因cDNA全長1 008 bp，編碼335個氨基酸的前體蛋白，具典型7次跨膜結構，并由單一外顯子編碼(Boninietal.，2001；Ohishietal.，2001)。GPR119一直以來被視為孤兒受體，但有文獻報道其可以被內源性配體溶血卵磷脂和油酰乙醇胺激活(Sogaetal.，2005；Overtonetal.，2006)。GPR119可與Gαs蛋白偶聯，結合配體后，可刺激下游cAMP水平上升(Holstetal.，2011)，進而刺激β細胞胰島素以及腸道K細胞的葡萄糖依賴性，促胰島素肽(GIP)和L細胞的胰高血糖素樣肽1(GLP-1)的釋放(Chuetal.，2008)。GIP與GLP-1是最重要的促胰島素釋放因子，由此，GPR119激動劑成為治療糖尿病藥物研發(fā)的重要候選對象，解析GPR119基因序列及其編碼蛋白結構備受關注(Kang，2013)。

盡管在哺乳動物中，GPR119的功能已逐步明確，但在包括鳥類在內的低等脊椎動物類群中，關于GPR119的研究幾屬空白。本研究以家雞Gallusgallus為研究對象，從其小腸組織中克隆得到1個似GPR119(GPR119-like)新基因，并確定其氨基酸序列。因該基因與雞和人的GPR119基因具較高序列同源性，因此將其命為cGPR119b。在此基礎上，本研究采用實時熒光定量PCR技術首次探究了cGPR119b在家雞組織中的表達情況。這些結果為探究家雞GPR119b的內源性配體、胞內信號通路，以及其在家雞組織中的生理效應奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本實驗中成體家雞全部購自成都活禽市場。家雞各組織放入液氮速凍后保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實驗試劑

本實驗中用于序列克隆的高保真DNA聚合酶(KOD-FX)體系、各種限制性內切酶、T4 DNA連接酶、Easy-Taq DNA聚合酶、dNTP、反轉錄酶購自TaKaRa；引物合成及測序由北京華大六和股份有限公司完成；RACE試劑盒購自Clontech；RNAzol購自Molecular Research Center；大腸桿菌EscherichacoliDH5α由本實驗室制備保存；DNA純化膠回收試劑盒購自上海生工生物有限公司。

1.3 方法

1.3.1總RNA提取取家雞心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟、肌肉、胰腺、精巢、卵巢、垂體，以及腦部各區(qū)域(大腦、下丘腦)和腸道分區(qū)(十二指腸、空腸、回腸、盲腸、直腸)，放入液氮中速凍，并于液氮中充分研磨，將組織粉末與RNAzol混合均勻，加入240 μL DEPC-H2O混勻，4 ℃、12 000 r·min-1離心15 min；取上清，加入3 μL阿司咪唑，漩渦后于4 ℃、12 000 r·min-1離心10 min；取上清，加入等體積異丙醇，4 ℃、12 000 r·min-1離心15 min；棄上清，加入70%的乙醇漂洗2次，4 ℃、12 000 r·min-1離心3 min；棄上清，用DEPC-H2O溶解沉淀，-80 ℃保存。

1.3.2RNA反轉錄以各組織RNA為模板，反轉錄獲得cDNA。反轉錄反應體系為：RNA 2 μg，Oligo-dT 1 μL，加DEPC-H2O補足至5 μL，70 ℃加熱10 min，取出后冰浴2 min；再加入2 μL 5×Buffer，dNTPs 0.5 μL(終濃度2 mmol·L-1)，MMLV逆轉錄酶0.5 μL，2 μL DEPC-H2O，42 ℃孵育1.5 h，70 ℃加熱10 min。反應產物用DEPC-H2O稀釋至50 μL，MiliQ-H2O作cDNA模板，-20 ℃貯存。

1.3.3引物設計根據NCBI數據庫中的預測序列(LOC101750121)設計引物(表1)，擴增cDNA獲得GPR119b基因全長，根據測序序列，設計檢測cGPR119b組織表達的特異性引物。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.3.4cGPR119b基因cDNA擴增以小腸cDNA為模板，采用PCR對cGPR119b基因進行擴增。PCR反應體系：5 μL 2×KOD Buffer，2 μL cDNA模板，2 μL 2 mmol·L-1dNTPs，0.1 μL rU1引物，0.1 μL rL1引物，0.2 μL KOD-Fx，加水補足至10 μL。反應條件為：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性10 s，62 ℃退火30 s，68 ℃延伸60 s，34個循環(huán)；最后72 ℃延伸20 min。取3 μL產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3.5利用5’-RACE獲取cGPR119b基因5’-UTR序列根據SMART RACE cDNA Amplification Kit試劑盒制備cDNA模板。在此基礎上，利用基因特異性引物PCR擴增cGPR119b基因的5’-UTR。PCR反應體系為：5 μL 2×KOD Buffer，2 μL cDNA模板，2 μL 2 mmol·L-1dNTPs，0.1 μL UPM引物，0.1 μL GSP引物，0.2 μL KOD-Fx，加水補足至10 μL。反應條件：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性10 s，72 ℃退火3 min，共5個循環(huán)；94 ℃變性10 s，70 ℃退火3 min，共5個循環(huán)；94 ℃變性10 s，68 ℃延伸3 min，25個循環(huán)；最后68 ℃延伸10 min。反應結束后，取3 μL產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。取上述產物稀釋1 000倍作為模板，進行第二輪巢氏PCR反應。PCR反應體系及條件同上。

對獲得的PCR產物進行加A反應。反應體系為：PCR產物4.5 μL，10×A-attachment Mix 0.5 μL，反應條件為60 ℃加熱1 h。將加A后的PCR產物進行TA連接，反應體系為：加A后反應液1.5 μL，2×Ligation Buffer 2.5 μL，pTA2載體0.5 μL，T4 DNA連接酶0.5 μL，總體積5 μL。將TA連接產物轉化DH5α進行菌落PCR篩選，將篩選到的陽性克隆進行質粒提取、雙向序列測定。

1.3.6cGPR119b基因的組織表達分析采用實時熒光定量PCR檢測cGPR119b基因在成體家雞各組織中的表達情況。PCR反應體系為：2 μL組織cDNA模板，1 μL 10×Easy-Taq Buffer，0.2 μL EvaGreen，0.2 μL dNTPs，0.15 μL qU1，0.15 μL qL1，0.15 μL Easy-Taq。PCR反應條件為：94 ℃預變性 2 min；94 ℃變性20 s，62 ℃退火15 s，72 ℃延伸15 s，34個循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。實時熒光定量PCR的結果按照2-ΔΔCT法進行數據分析(Schmittgen & Livak，2008)，步驟如下：首先將各組織樣品cGPR119b基因的CT值減去對應組織內參基因β-actin的CT值，得到各組織的ΔCT值；然后將cGPR119b基因在回腸中的表達量選作參考，并將上一步分別所得的各組織的ΔCT值減去回腸組織的平均ΔCT值，得到ΔΔCT值；最后計算2-ΔΔCT值，得到各組織相對回腸中cGPR119b基因的表達量倍數，即cGPR119b基因在各組織間的相對表達量。

2 結果

2.1 cGPR119b基因編碼區(qū)序列克隆

以小腸cDNA為模板，根據表1引物rU1+rL1，進行PCR擴增，得到cGPR119b基因編碼區(qū)的全長cDNA序列。擴增片段約為1 kb，與預測基因片段大小一致(圖1)。將該片段進行膠回收，并克隆到pTA2載體上，經陽性克隆篩選與酶切驗證后，選3個克隆進行測序分析。序列比對顯示，成功克隆到cGPR119b基因的編碼區(qū)序列。

圖1 cGPR119b基因開放閱讀框區(qū)域擴增Fig. 1 Amplification of the open reading frame of chicken GPR119b-like gene

2.2 cGPR119b基因編碼區(qū)序列分析

cGPR119b基因開放閱讀框長954 bp，由單一外顯子編碼，編碼317個氨基酸的前體蛋白。與其他GPCRs一致，cGPR119b同樣含典型7次跨膜結構域，在第二胞內區(qū)前端有1個D-R-Y基序(圖2)。通過與家雞基因組序列進行比對分析，發(fā)現cGPR119b基因位于家雞9號染色體上。cGPR119b的氨基酸序列與家雞及人GPR119序列相似度相對較低(35%～36%)，但與綠頭鴨Anasplatyrhynchos(XM_013100626)、綠海龜Cheloniamydas(XM_007072744)、西部錦龜Chrysemyspictabellii(XM_005310936)和火雞Meleagrisgallopavo(XM_010715066)的GPR119b具有很高的一致性，分別為79.9%、61.0%、62.3%和95.5%(圖2)。

圖2 家雞(Gg)GPR119b的氨基酸序列與綠頭鴨 (Ap)、綠海龜 (Cm)、西部錦龜 (Cb)、火雞 (Mg)的比對分析Fig. 2 Amino acid sequence alignment of chicken (Gg) GPR119b with that of Anas platyrhynchos (Ap)，Chelonia mydas (Cm)， Chrysemys picta bellii (Cb)， Meleagris gallopavo (Mg)

陰影部分顯示7次跨膜區(qū)， 方框顯示視紫紅質亞家族的典型“D-R-Y”基序， 圓點表示與家雞GPR119b相同的氨基酸殘基， 破折號表示氨基酸殘基的缺失

The putative seventransmembrane domains (TM1-7) were shaded, the“D-R-Y”motif was boxed, dots indicate the amino acids identical to chicken GPR119b and dashes indicate the gaps in the sequence

2.3 cGPR119b基因5’-UTR的確定

為探究cGPR119b基因的結構，以小腸cDNA為模板，采用5’-RACE方法擴增cGPR119b基因的5’-UTR區(qū)域，成功獲得5’-UTR序列。結果顯示，cGPR119b基因的5’-UTR大小為678 bp。通過與家雞基因組序列比對，發(fā)現該區(qū)域不含新的外顯子。由此可知，與GPR119基因一致，cGPR119b基因也由單一外顯子組成(圖3)。

2.4 cGPR119b基因組織表達分析

實時熒光定量PCR結果顯示，cGPR119b基因在大腦、肝臟、腎臟、卵巢、精巢、垂體、胰腺、皮膚、脂肪、肺、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、直腸等組織有表達。其中，cGPR119b基因在肝臟、腎臟、盲腸和精巢的表達量較高；在胰腺、皮膚、脂肪和肺等組織中僅有微量表達，而在下丘腦和脾臟不表達(圖4)。

3 討論

GPR119是A型視紫紅質G蛋白偶聯受體家族成員。在哺乳類動物中，該基因高表達于胰腺β細胞和PP細胞以及小腸組織的內分泌L細胞，參與胰島素的釋放調節(jié)，成為制藥公司研發(fā)糖尿病治療用藥的靶標，備受關注(Moranetal.，2016)。本文首次報道了cGPR119b基因序列及其組織表達圖譜，研究結果為探究cGPR119b基因在家雞中的生理效應奠定基礎。

利用RT-PCR技術成功從家雞小腸中克隆得到cGPR119b基因的完整編碼區(qū)序列。序列分析顯示，cGPR119b基因的cDNA全長954 bp，編碼具317個氨基酸的前體蛋白，該蛋白由單一外顯子編碼，具典型7次跨膜結構域，第二胞內區(qū)域前端含D-R-Y基序。氨基酸序列對比發(fā)現，家雞GPR119b分別與綠頭鴨、綠海龜、西部錦龜和火雞中預測的GPR119b有79.9%、61.0%、62.3%、95.5%的序列相似度，但與人、小鼠和家雞GPR119(JQ768805，本實驗室已克隆)的序列相似度則較低，因此，本研究將該似GPR119基因命名為cGPR119b。有趣的是，GPR119b基因在哺乳動物中已消失。

圖3 cGPR119b的基因組成(5’-UTR+編碼區(qū))(A)及其5’-UTR區(qū)域核苷酸序列(B)Fig. 3 Composition of chicken GPR119-like gene (cGPR119b) (A) and its 5’-UTR region nucleotide sequence (B)

圖4 cGPR119b基因在家雞組織中的表達Fig. 4 Chicken GPR119b-like gene expression in chicken tissues

IL. 回腸， Br. 大腦， Sp. 脾臟， Ki. 腎臟， Ov. 卵巢， Te. 精巢， Pi. 垂體， Pa. 胰腺， Fat. 脂肪， Du. 十二指腸， Je. 空腸， Lu. 肺， Ce. 盲腸， Li. 肝臟， Re. 直腸， Hy.下丘腦， Sk. 皮膚

IL. ileum， Br. brain， Sp. spleen， Ki. kidney， Ov. ovary， Te. testis， Pi. pituitary， Pa. pancreas， Fat. fat， Du. duodenum， Je. jejunum， Lu. lung， Ce. cecum， Li. liver ， Re. rectum， Hy. hypothalamus， Sk. skin

采用5’-RACE技術成功獲得cGPR119b基因的5’-UTR。測序結果顯示，該5’-UTR長度為678 bp，暗示該5’-UTR區(qū)或含未知調控序列，或參與控制cGPR119b基因翻譯效率。利用實時熒光定量PCR方法解析cGPR119b基因在家雞組織中的表達圖譜，發(fā)現cGPR119b基因在肝臟、精巢、腎臟和盲腸等組織表達量較高，而在胰腺和腸分區(qū)組織中的表達量較低。該結果與哺乳動物GPR119基因的組織表達存在較大差異(Chuetal.，2007；Odorietal.，2013)。在大鼠中，GPR119基因主要在胰腺組織表達(Sakamotoetal.，2006)；在人中，GPR119基因在胰腺和腸內分泌細胞高表達(Chuetal.，2008)。GPR119基因在家雞中存在2個拷貝(cGPR119與cGPR119b)。家雞GPR119b基因組織表達圖譜區(qū)別于其在人、大鼠中的表達圖譜，這一結果暗示：cGPR119b基因或與哺乳動物及家雞GPR119基因的功能顯著不同，值得深入探究。

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