異育銀鯽過(guò)氧化物還原酶基因的克隆及其表達(dá)分析

稅典章， 陳勝峰， 吳萍， 葉元土， 陳佳， 張晶晶

(蘇州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，江蘇蘇州215123)

異育銀鯽是以天然雌核發(fā)育的方正銀鯽Carassiusauratusgibelio(Bloch)為母本、興國(guó)紅鯉Cyprinuscarpiovar.singuonensis為父本，經(jīng)異精雌核發(fā)育得到的子代(徐文斌，孫曉波，1993)。它具有生長(zhǎng)迅速、食性廣泛、捕撈容易、耐低氧、繁殖方便和經(jīng)濟(jì)價(jià)值高等優(yōu)點(diǎn)，在養(yǎng)殖生產(chǎn)中顯示出良好的經(jīng)濟(jì)性狀(潘庭雙等，2001)，其養(yǎng)殖業(yè)在淡水漁業(yè)中占據(jù)十分重要的地位(陳靜等，2014)。然而近年來(lái)，因感染鯉皰疹病毒Ⅱ型(cyprinid herpesvirusⅡ， CyHV-2)導(dǎo)致的鰓出血病，嚴(yán)重威脅著異育銀鯽的養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)，某些染病塘口的死亡率甚至高達(dá)100%(張晗，2014)。了解異育銀鯽的非特異性免疫及免疫防御機(jī)制，是提高異育銀鯽抗病能力的基礎(chǔ)。進(jìn)行異育銀鯽Prx基因的研究，不僅可為研究其先天免疫反應(yīng)機(jī)制提供基礎(chǔ)資料，也可為研究其他魚類的抗病機(jī)制提供借鑒。

本研究從異育銀鯽轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的結(jié)果中鑒定了Prx基因的部分序列，利用反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)和cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)(rapid amplification of cDNA ends，RACE)克隆了其cDNA全長(zhǎng)，預(yù)測(cè)了蛋白質(zhì)序列、進(jìn)行了系統(tǒng)進(jìn)化分析；研究了異育銀鯽過(guò)氧化物還原酶(CaPrx)基因的組織表達(dá)特征，并比較了它在健康和感染CyHV-2的異育銀鯽體內(nèi)的表達(dá)差異，以期為異育銀鯽的健康養(yǎng)殖提供理論依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)魚健康的異育銀鯽由江蘇省東臺(tái)市林華水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司提供，二夏齡，體質(zhì)量為98～188 g，共120尾，其中雌魚70尾。自然發(fā)病的魚體由江蘇省大豐市華辰水產(chǎn)實(shí)業(yè)有限公司提供，二夏齡，體質(zhì)量89～141 g，共36尾，其中雌魚22尾。病魚全身發(fā)黑，背鰭和尾鰭末端發(fā)白，眼球充血突出，肌肉充血，鰓呈鮮紅色，鰓絲出血，在鰓絲末端有紅色斑塊。抽取健康魚血液，解剖取出鰓、腸道、肝臟、脾臟、頭腎、中腎、表皮和肌肉等組織；解剖病魚并取出肝臟和脾臟。上述組織在DEPC水配制的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)中漂洗后，經(jīng)液氮冷凍，于-80 ℃保存，用于總RNA提取。

1.1.2試劑大腸桿菌EscherichiacoliDH5α感受態(tài)細(xì)胞、瓊脂糖購(gòu)自Invitrogen；DEPC購(gòu)自上海生工生物公司；PrimeScriptTMRTase逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、pMD19-T載體、Trizol、DNA聚合酶Ⅰ、SYBR Premix Ex Taq、dNTP、rTaq酶、DNA Marker購(gòu)自TaKaRa；SMARTTMRACE cDNA擴(kuò)增試劑盒購(gòu)自Clontech。

1.2 患病魚體的鑒定

根據(jù)CyHV-2病毒序列(KM200722.1)設(shè)計(jì)引物CyHV-2-F、CyHV-2-R(表1)，以病魚各組織DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，25 μL反應(yīng)體系如下：滅菌蒸餾水16.2 μL、rTaq酶0.3 μL、10×PCR Buffer(Mg2+Plus)2.5 μL、2.5 mM dNTP Mixture2 μL、模板DNA 2 μL、上下游引物(10 μM)各1 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃40 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 40 s，共25個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。所得PCR產(chǎn)物送蘇州金唯智科技有限公司測(cè)序，序列結(jié)果在NCBI上進(jìn)行BlastX比對(duì)分析。

1.3 總RNA的提取和第一鏈cDNA的合成

取-80 ℃保存的各組織樣品于液氮中研磨，參照Trizol使用說(shuō)明書進(jìn)行總RNA提取。用DNase Ⅰ對(duì)RNA進(jìn)行消化處理，所得RNA經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)濃度，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，按照PrimeScriptTMRT 1st strand cDNA Synthesis Kit試劑盒說(shuō)明書合成cDNA的第一鏈，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 CaPrx基因、β-actin基因核心序列的克隆

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室異育銀鯽轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果所鑒定的Prx基因、β-actin基因cDNA序列設(shè)計(jì)引物Prx-F、Prx-R、actin-F和actin-R(表1)。以異育銀鯽肝臟cDNA為模板，采用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增CaPrx、β-actin基因。25 μL反應(yīng)體系如下：滅菌蒸餾水16.2 μL、rTaq酶0.3 μL、10×PCR Buffer(Mg2+Plus)2.5 μL、2.5 mM dNTP Mixture 2 μL、模板cDNA 2 μL、上下游引物(10 μM)各1 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃ 40 s、57 ℃40 s、72 ℃ 40 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳、回收、連接、轉(zhuǎn)化后，挑選單克隆送蘇州金唯智科技有限公司測(cè)序，所得cDNA片段與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的已知序列進(jìn)行BlastX同源性分析。

1.5 CaPrx基因全長(zhǎng)cDNA序列的獲得

根據(jù)上述克隆測(cè)序獲得的CaPrx基因cDNA片段序列，設(shè)計(jì)3’RACE引物3-Prx-inner、3-Prx-outer和5’RACE引物5-Prx-inner、5-Prx-outer(表1)。以異育銀鯽肝臟總RNA為模板，根據(jù)SMARTTMRACE cDNA擴(kuò)增試劑盒說(shuō)明書分別合成3’-RACE-Ready cDNA和5’-RACE-Ready cDNA。分別以3’-RACE-Ready cDNA和5’-RACE-Ready cDNA為模板，以引物UPM和基因特異outer引物進(jìn)行首輪PCR擴(kuò)增，電泳檢測(cè)并將PCR產(chǎn)物稀釋50倍后，以引物NUP和基因特異inner引物進(jìn)行巢式PCR反應(yīng)。PCR產(chǎn)物純化、克隆和測(cè)序方法同1.4。

1.6 CaPrx基因的同源性對(duì)比、全長(zhǎng)cDNA序列特征分析及進(jìn)化樹構(gòu)建

用Vector NTI Suite對(duì)獲得的cDNA序列進(jìn)行拼接。使用NCBI的ORF Finder對(duì)獲得的序列作開放閱讀框(ORF)分析(www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)，預(yù)測(cè)編碼氨基酸序列。通過(guò)NCBI BlastP(http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/)進(jìn)行同源性分析。異育銀鯽Prx蛋白與其他物種氨基酸序列的比較使用Clustal W多序列對(duì)比和BioEdit分析。用MEGA 6.0以鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，分子節(jié)點(diǎn)支持率采用1 000次重復(fù)抽樣檢測(cè)。利用PROTPARAM(http：//expasy.org/tools/protparam.html)分析蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)，信號(hào)肽的預(yù)測(cè)使用Signal P(http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)。

1.7 異育銀鯽不同組織中CaPrx基因的mRNA表達(dá)

以1.3中獲得的不同組織的cDNA稀釋10倍為模板，以獲得的CaPrx基因設(shè)計(jì)特異引物Prx-q-F和Prx-q-R，以本研究獲得的異育銀鯽β-actin基因序列(NCBI登錄號(hào)：MF463002)設(shè)計(jì)內(nèi)參引物actin-q-F和actin-q-R(表1)。以無(wú)菌水作為陰性對(duì)照。20 μL反應(yīng)體系為：滅菌蒸餾水6 μL，SYBR Premix Ex Taq 10 μL，稀釋的cDNA樣本2 μL，8 μM的上、下游引物各1 μL。實(shí)驗(yàn)儀器為L(zhǎng)ineGene9600熒光定量PCR儀。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性20 s；95 ℃ 15 s，60 ℃ 2 s，共40個(gè)循環(huán)；熔解段95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s、95 ℃ 15 s。每次反應(yīng)都通過(guò)從95 ℃降至60 ℃(4 ℃/s)繪出熔解曲線。反應(yīng)結(jié)果用2-ΔΔCt方法分析(Livak & Schmittgen，2001)。用SPSS處理數(shù)據(jù)。

表1 引物名稱及序列Table 1 Primer used in this study

1.8 CyHV-2人工感染異育銀鯽及CaPrx基因的mRNA表達(dá)

實(shí)驗(yàn)前取患病異育銀鯽的內(nèi)臟組織按1∶6(w/v)0.75%滅菌生理鹽水制作組織勻漿，-80 ℃至室溫反復(fù)凍融3次，5 000 r·min-1離心10 min，所得上清液過(guò)0.45 μm濾膜除菌后，收集濾液置于4 ℃?zhèn)溆?劉文枝等，2013)。每尾魚腹腔注射0.3 mL病毒液，對(duì)照組每尾注射0.3 mL生理鹽水，每組設(shè)3個(gè)平行處理。攻毒實(shí)驗(yàn)完成后12 h、24 h和48 h采樣，取肝臟和脾臟組織，在DEPC水配制的PBS中漂洗后，經(jīng)過(guò)液氮冷凍，于-80 ℃保存。提取RNA后，經(jīng)過(guò)DNaseⅠ消化，電泳，用于cDNA的合成。具體參見(jiàn)1.3。得到的cDNA用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)抗氧化還原酶基因的表達(dá)，方法同1.7。

2 結(jié)果

2.1 異育銀鯽感染CyHV-2的鑒定

患病異育銀鯽組織樣本以CyHV-2-F、CyHV-2-R為引物，PCR結(jié)果呈陽(yáng)性，獲得了239 bp的特異性條帶(圖1)，測(cè)序結(jié)果經(jīng)BlastX比對(duì)，確定其與CyHV-2 DNA解旋酶序列完全一致，表明病魚感染了CyHV-2。

圖1 感染CyHV-2異育銀鯽的PCR檢測(cè)Fig. 1 PCR assay of Carassius auratus gibelioinfected with CyHV-2

M. DL2000 Marker， 1～4. 病魚樣品the diseased fish， 5～8. 健康魚樣品the healthy fish

2.2 CaPrx基因的克隆

以異育銀鯽肝臟cDNA為模板，以Prx-F和Prx-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得591 bp的PCR產(chǎn)物，克隆測(cè)序后，結(jié)果經(jīng)BlastX分析確定為CaPrx基因目的片段。5’端和3’端經(jīng)巢式PCR擴(kuò)增得到特異性條帶，條帶分別長(zhǎng)328 bp和700 bp(圖2)。對(duì)其進(jìn)行克隆、測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)分析拼接后，獲得CaPrx基因的全長(zhǎng)cDNA序列(GenBank登錄號(hào)：MF346707)。

2.3 CaPrx基因全長(zhǎng)序列特征

CaPrx基因cDNA序列全長(zhǎng)1 035 bp，ORF長(zhǎng)594 bp，位于76～669 bp處；5’非編碼區(qū)長(zhǎng)75 bp，3’非編碼區(qū)長(zhǎng)366 bp，共編碼197個(gè)氨基酸；預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的分子量為21.83 kD，理論等電點(diǎn)為5.93。3’非編碼區(qū)中具有典型的加尾信號(hào)AATAAA(圖3)。

圖2 異育銀鯽Prx基因RACE電泳圖Fig. 2 RACE of Prx gene from Carassius auratus gibelio

A. 5’-RACE ofPrxgene， B. 3’-RACE ofPrxgene， M. DL2000 Marker， 1. 5’-Prx-inner， 2. 3’-Prx-inner

通過(guò)NCBI Conserved Domain Search搜索分析，CaPrx蛋白氨基酸有一個(gè)保守結(jié)構(gòu)域PRX_Typ2cys(8～179)，屬于Thioredoxin_like superfamily超蛋白家族。CaPrx基因翻譯的蛋白無(wú)信號(hào)肽，在氨基酸序列的N端和C端各有1個(gè)保守的半胱氨酸(Cys)殘基，位于保守的“FYPLDFTFVCPTEI”和“GEVCPA”序列中。

2.4 CaPrx基因的同源性比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化分析

圖3CaPrx基因cDNA全長(zhǎng)以及推導(dǎo)的氨基酸序列
Fig. 3 Nucleotide (upper row) and deduced amino-acid (lower row) sequences ofCaPrxfull-length cDNA

起始密碼子、終止密碼子和加尾信號(hào)用下劃線標(biāo)出， 保守序列用方框標(biāo)出， 保守Cys用陰影顯示

The predicted start codon (ATG)， stop codon and the polyadenylation signal sequence (AATAAA) are indicated with underline， conserved sequences are indicated with shadows， the conserved Cys in the sequence is indicated with shadows

圖4 Prx蛋白的氨基酸多序列對(duì)比Fig. 4 Alignment of the deduced amino acid sequences of Prx

陰影表示序列中絕對(duì)保守或高度保守的氨基酸 the shadows represent conserved amino acids in the proteins， Prx的保守序列用方框顯示 conserved sequences of Prx are indicated with boxes， 本實(shí)驗(yàn)所得異育銀鯽Prx用下劃線標(biāo)出 Prx ofCarassiusauratusgibelioin this study is indicated with underline； 登錄號(hào)GenBank accession numbers： 鯽Carassiusauratus(AGO58900.1)， 印度明對(duì)蝦Fenneropenaeusindicus(ACS91344.1)， 三疣梭子蟹Portunustrituberculatus(ACI46625.1)， 黑腹果蠅Drosophilamelanogaster(NP_477510.1)， 絨啄木鳥Picoidespubescens(KFV68516.1)， 獅鬃水母Cyaneacapillata(AHL38196.1)， 褐家鼠Rattusnorvegicus(NP_476455.1)， 異育銀鯽Carassiusauratusgibelio(MF346707)

圖5 基于Prx氨基酸序列構(gòu)建的鄰接系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 5 Neighbor-joining phylogenetic tree constructed from the amino acid sequences of Prx

2.5 CaPrx基因的組織表達(dá)特征

以β-actin基因?yàn)閮?nèi)參，以肝臟的基因表達(dá)量為標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，CaPrxmRNA在肝臟、血細(xì)胞、脾臟、肌肉、心臟和中腎等組織中均有表達(dá)(圖6)，是一種廣泛表達(dá)的基因。其中，在血細(xì)胞中表達(dá)量最高，約為肝臟表達(dá)量的1.1倍，其次是肝臟。在腸道和肌肉中也有較高表達(dá)，分別為肝臟表達(dá)量的80%和65%。而在其他組織中的表達(dá)量明顯低于肝臟和血細(xì)胞。其中，在鰓和頭腎中的表達(dá)量最少，約為肝臟表達(dá)量的10%。此外，在脾臟、心臟、腦、中腎和表皮中也有表達(dá)。

2.6 異育銀鯽人工感染CyHV-2后CaPrx基因的表達(dá)變化

健康的異育銀鯽在人工感染CyHV-2后，CaPrxmRNA在肝臟和脾臟中均出現(xiàn)了差異性表達(dá)。在感染12 h后，肝臟中CaPrxmRNA的表達(dá)量顯著上升，約為健康魚的3倍(P<0.05)，24 h時(shí)急劇下降至略低于健康時(shí)的水平，48 h時(shí)降至更低點(diǎn)，與自然發(fā)病魚體內(nèi)的CaPrxmRNA表達(dá)量持平。與健康異育銀鯽相比，自然患病的CaPrxmRNA的表達(dá)量幾乎下降了80%。與CaPrxmRNA在肝臟中的表達(dá)情況不同，異育銀鯽在人工感染病毒后，脾臟中CaPrxmRNA的表達(dá)量在12 h、24 h、48 h均顯著下降。相較于病毒感染后2 d內(nèi)脾臟中CaPrxmRNA的表達(dá)量，自然發(fā)病的異育銀鯽脾臟中CaPrxmRNA的表達(dá)量有所上升(圖7)。

3 討論

3.1 CaPrx的結(jié)構(gòu)與功能

Prx屬于抗氧化蛋白超家族，廣泛存在于原核生物和真核生物中。該家族所有蛋白均在N端具有保守的Cys殘基，有的成員在C端還具有保守的Cys。根據(jù)其保守Cys的數(shù)目，可以分為2個(gè)亞家族，即1-Cys Prx和2-Cys Prx家族(Hofmanetal.，2002；Muetal.，2009)。CaPrx氨基酸序列的N-端和C-端各有1個(gè)保守的Cys殘基，這是2-Cys Prx家族中Prx所特有的結(jié)構(gòu)，這2個(gè)Cys殘基在Prx的催化功能中具有關(guān)鍵作用。以上特征說(shuō)明CaPrx基因?qū)儆?-Cys Prx家族。2-Cys Prx家族基因已被證明參與過(guò)氧化氫在真核生物的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑(Kangetal.，2005；Halletal.，2009)。2-Cys Prx以同源二聚體形式存在，在發(fā)揮抗氧化作用時(shí)，一條肽鏈上的Cys51巰基與另一肽鏈上的Cys172巰基之間脫氫形成分子間二硫鍵，即Cys51SSCys172，以供氫而還原氧化(Wooetal.，2003；章波等，2004)。同時(shí)，CaPrx基因序列存在2個(gè)特征肽段：“FYPLDFTFVCPTEI”和“FYPLDFT”，是典型2-Cys Prx的2個(gè)Cys的催化中心。另外，基于Prx的氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹也反映出，本實(shí)驗(yàn)克隆的CaPrx基因?qū)儆赑rx2類，是2-Cys Prx家族的一員。因此，推測(cè)CaPrx基因可能參與異育銀鯽體內(nèi)的抗氧化作用?，F(xiàn)已證實(shí)，除了Prx4基因，Prx基因家族的其他5種均沒(méi)有信號(hào)肽(章波等，2004)。CaPrx基因翻譯的蛋白預(yù)測(cè)無(wú)信號(hào)肽，說(shuō)明它并不是一種分泌蛋白，因?yàn)樾盘?hào)肽可引導(dǎo)新合成的蛋白向分泌通路轉(zhuǎn)移，而CaPrx基因可能只是由游離的核糖體合成，主要定位于胞漿或核內(nèi)(Von，1990)。這與斑馬魚Prx2基因的研究結(jié)果一致(孫晶，薛壯，2015)。

圖6CaPrx基因在各組織中的表達(dá)情況
Fig. 6 The expression ofCaPrxmRNA in different tissues

HK. 頭腎head kidney， G. 鰓gill， E. 表皮epidermis， MK. 中腎middle kidney， B. 腦brain， H. 心臟heart， S. 脾臟spleen， M. 肌肉muscle，I. 腸道intestines， He. 血細(xì)胞hemocyte， L. 肝臟liver

圖7 健康異育銀鯽和感染CyHV-2病魚的Prx基因的差異表達(dá)Fig. 7 The significance expression of CaPrx mRNA between healthy and diseased Carassius auratus gibelio

柱狀圖上方不同字母表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，n=3)， 肝臟組用abc表示， 脾臟組用ABC表示

Significant differences (P<0.05，n=3) are shown in different letters above the histogram， with the liver group indicated by abc and the spleen group indicated by ABC

3.2 CaPrx的組織表達(dá)分析

根據(jù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR的結(jié)果，CaPrx基因在肝臟、血細(xì)胞、腸道、鰓和肌肉等組織中均有表達(dá)，說(shuō)明CaPrx基因可能參與了異育銀鯽體內(nèi)的多項(xiàng)生理活動(dòng)，這個(gè)結(jié)果與日本囊對(duì)蝦Marsupenaeusjaponicus的研究結(jié)果相近(Maningasetal.，2008)。鑒于CaPrx基因的結(jié)構(gòu)，推測(cè)其參與了清除自由基ROS、免疫應(yīng)答和細(xì)胞凋亡等，具有廣泛的抗氧化作用。研究結(jié)果顯示，CaPrx基因在血液、肝臟和腸道中的表達(dá)量較高。血液是運(yùn)輸氧的組織，也是新陳代謝的重要場(chǎng)所；同時(shí)，血細(xì)胞中的單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞等都參與了魚體的免疫防御。因此，CaPrx基因在血液中的高表達(dá)一方面說(shuō)明了魚體的生理代謝需要有足夠的Prx來(lái)清除ROS，另一方面揭示了CaPrx基因與異育銀鯽的免疫功能有關(guān)。已有研究報(bào)道，動(dòng)物肝中的線粒體是產(chǎn)生ROS的主要場(chǎng)所(Tayloretal.，1995)，大量ROS能夠?qū)е氯毡菊游rMacrobrachiumnipponense肝胰腺中Prx基因表達(dá)量顯著升高(孫盛明等，2014)。異育銀鯽肝臟Prx基因的高表達(dá)在一定程度上也說(shuō)明了肝臟是異育銀鯽重要的抗氧化器官。此外，CaPrx基因在腸道中的表達(dá)也相對(duì)較高。由于腸道是能量與代謝十分旺盛的系統(tǒng)(陳群，2007)，在營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收過(guò)程中起重要作用，同時(shí)，腸道時(shí)刻面臨由食物氧化、重金屬、細(xì)菌代謝等產(chǎn)生的高含量ROS而帶來(lái)的危害，腸黏膜產(chǎn)生Prx有利于對(duì)抗ROS對(duì)機(jī)體的傷害(Dongetal.，2007)。組織表達(dá)顯示，CaPrx基因在異育銀鯽心臟中的表達(dá)量并不高。Schr?der等(2008)認(rèn)為Prx基因在心臟中的表達(dá)量較高，是心臟面對(duì)氧化應(yīng)激的重要因子。同時(shí)，Kumar等(2009)發(fā)現(xiàn)，在面對(duì)外界刺激如缺血和再灌注時(shí)，存在于線粒體中的Prx3會(huì)快速氧化成二硫化二聚體，含量發(fā)生顯著變化，而存在于胞質(zhì)中的Prx1和Prx2則沒(méi)有變化，因此，心臟中的Prx3被認(rèn)為是維持心臟功能的主要貢獻(xiàn)者。

3.3 CaPrx與免疫應(yīng)答

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