基于UPLC的獨一味中8種成分測定及其含量影響因素初步研究

茍燕梅+鐘世紅+古銳+趙燦+楊春生

[摘要] 建立同時測定獨一味中胡麻屬苷、山梔苷甲酯、綠原酸、咖啡酸、8-O-乙酰山梔苷甲酯、連翹酯苷B、木犀草苷和麥角甾苷8種成分含量的方法。采用Kinetex XB-C18色譜柱（4.6 mm×50 mm，2.6 μm）以乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B）為流動相進(jìn)行梯度洗脫（0～10 min，6%～14.5% A；10～18.5 min，14.5%～17% A；18.5～23 min，17%～18% A），流速1.0 mL·min-1，檢測波長238，320，350 nm，柱溫30 ℃。結(jié)果發(fā)現(xiàn)8個成分分離度良好，在線性范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系（r≥0.999 8），平均加樣回收率96.61%～100.4%。該方法操作簡便，專屬性好，精密度高，可用于獨一味藥材的鑒別及質(zhì)量評價。研究表明，獨一味各類成分之間具有相關(guān)性；產(chǎn)地是影響?yīng)氁晃冻煞趾康闹饕蛩?；退化梯度對其含量影響不明顯；樣品儲藏一年后胡麻屬苷含量顯著降低。

[關(guān)鍵詞] 獨一味； 超高效液相色譜； 含量測定； 環(huán)烯醚萜苷； 苯乙醇苷

[Abstract] To establish a method for simultaneous determination of the contents of sesamoside， menthyl chloride， chlorogenic acid， caffeic acid， 8-O-acetyl-phloridzin methyl ester， forsythiaside B， luteolin， and ergosterol， the LIPLC analysis was performed on a Kinetex XB-C18 （4.6 mm×50 mm，2.6 μm）column with acetonitrile （A）-0.1% phosphoric acid solution （B） as the mobile phase. The flow rate is 1.0 mL min-1. The detection wavelength was 238， 320 and 350 nm and column temperature was 30 ℃. The results showed that the eight components could be completely separated with good linear relationships （r ≥ 0.999 8） in the linear range. The average recoveries were 96.61% -100.4%. The method was simple with strong specificity and high precision. It can be used for the identification and quality evaluation of the Lamiophlomis rotate.The results also showed that there was a correlation between the various components， and the habitat was the main factor affecting the content of the eight components. However， the degradation gradient had no obvious effect on the contents， while the content of sesamoside was significantly decreased after one year of storage.

[Key words] Lamiophlomis rotate； UPLC； contents determination； iridoid glycosides； phenethyl alcohol glycoside

獨一味Lamiophlomis rotata （Benth.）Kudo為唇形科獨一味屬植物，藏語稱“大巴”、“打布巴”，主要分布于我國中西部地區(qū)如西藏、青海、甘肅和四川等地，海拔2 700～4 500 m的高原或高山上強度風(fēng)化的碎石灘中或石質(zhì)高山草甸、河灘地。獨一味為藏族、蒙古族、納西族等少數(shù)民族常用草藥，具有活血止血，祛風(fēng)止痛之功效，用于跌打損傷，外傷出血，風(fēng)濕痹痛，黃水病等[1]。近年來獨一味顯著的鎮(zhèn)痛作用備受關(guān)注[2-3]，現(xiàn)有膠囊和分散片等多種產(chǎn)品，廣泛用于各種疼痛、出血證的治療，且長期給藥不產(chǎn)生耐受性。持續(xù)過度采摘使得獨一味野生資源蘊藏量急劇下降，被列為一級瀕危藏藥品種[4]，《中國藥典》自2010年版起將獨一味的藥用部位由根莖更改為地上部分，以保護(hù)該野生資源的可持續(xù)利用。

獨一味中含有多種有效成分，主要有環(huán)烯醚萜苷、苯乙醇苷和黃酮類等三大類成分，苯乙醇苷類具有一定的鎮(zhèn)痛活性[5]，黃酮類具有一定的抗炎活性[6]，環(huán)烯醚萜類為主要鎮(zhèn)痛、抗炎、止血的有效成分[7]。獨一味的質(zhì)量評價多采用HPLC測定其中的1～2類成分，同時測定的成分?jǐn)?shù)目有限且耗時偏長[8-9]。為了縮短分離時間，提高分離效率，本試驗采用UPLC（ultra performance liquid chromatography）同時測定獨一味中胡麻屬苷、山梔苷甲酯、綠原酸、咖啡酸、8-O-乙酰山梔苷甲酯、連翹酯苷B、木犀草苷和麥角甾苷共8種成分，涵蓋多類指標(biāo)成分，包括了3種環(huán)烯醚萜苷、2種苯乙醇苷、1種黃酮及2種咖啡酰，且專屬性好，精密度高。對不同產(chǎn)地，不同草地退化等級及貯存時間對獨一味成分含量的影響進(jìn)行了初步分析。本研究可為獨一味藥材的鑒別、質(zhì)量評價及可持續(xù)利用提供科學(xué)依據(jù)。endprint

1 材料

Prominence UFLC XR超快速液相色譜儀（日本島津）、BSA124S電子天平（德國賽多利斯）、UPH-I-10T型超純水器、Kinetex XB-C18色譜柱（4.6 mm×50 mm，2.6 μm）。胡麻屬苷、山梔苷甲酯、綠原酸、咖啡酸、8-O-乙酰山梔苷甲酯、連翹酯苷B、木犀草苷、麥角甾苷對照品均來自成都曼斯特生物科技有限公司，乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。獨一味32批，2015年7—8月自采或購買，經(jīng)成都醫(yī)學(xué)院鐘世紅教授鑒定為獨一味L. rotata的干燥地上部分。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Kinetex XB-C18色譜柱（4.6 mm×50 mm，2.6 μm），流動相乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～10 min，6%～14.5% A；10～18.5 min，14.5%～17% A；18.5～23 min，17%～18% A）；流速1.0 mL·min-1；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量2 μL。胡麻屬苷、山梔苷甲酯、8-O-乙酰山梔苷甲酯檢測波長為238 nm，綠原酸、咖啡酸、連翹酯苷B、麥角甾苷檢測波長為320 nm，木犀草苷檢測波長為350 nm。上述色譜條件下，樣品各色譜峰保留時間適中，樣品中各組分的色譜峰分離度良好，對照品及樣品圖見圖1。

2.2 對照品溶液制備 稱取減壓干燥至恒重的對照品適量，加入甲醇配制成每1 mL含胡麻屬苷0.275 mg、山梔苷甲酯0.278 mg、綠原酸0.494 mg、咖啡酸0.036 mg、8-O-乙酰山梔苷甲酯0.328 mg、連翹酯苷B 0.448 mg、木犀草苷0.422 mg、麥角甾苷0.334 mg的混合對照品A溶液。精密吸取混合對照品A 1.0 mL，置10 mL量瓶中，加入甲醇稀釋至刻度，作為稀釋后的混合對照品B溶液。

2.3 供試品溶液制備 取獨一味粉末（中粉）約0.5 g，精密稱定，加入70%甲醇30 mL，精密稱定，回流提取60 min，冷卻后補足失重，搖勻，靜置，經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 線性關(guān)系考察 分別吸取2.2項混合對照品B溶液1，2，4 μL，混合對照品A溶液4，8 μL，進(jìn)樣分析。以進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得到各對照品的回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍，結(jié)果見表1。

2.5 精密度試驗 取同一供試品（S4）2 μL，重復(fù)進(jìn)樣5次，計算得胡麻屬苷、山梔苷甲酯、綠原酸、咖啡酸、8-O-乙酰山梔苷甲酯、連翹酯苷B、木犀草苷、麥角甾苷峰面積RSD分別是0.28%，0.50%，1.2%，0.50%，0.53%，0.21%，1.4%，0.16%。表明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗 取同一供試品（S4）粉末6份，分別按2.2項方法制備供試品溶液，按2.1項色譜條件測定。結(jié)果胡麻屬苷、山梔苷甲酯、綠原酸、咖啡酸、8-O-乙酰山梔苷甲酯、連翹酯苷B、木犀草苷、麥角甾苷峰面積RSD分別是0.49%，0.33%，1.6%，0.73%，0.64%，0.58%，0.98%，0.75%。表明方法的重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一供試品溶液（S4），分別于0，1，2，4，6，12，24 h時進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果胡麻屬苷、山梔苷甲酯、綠原酸、咖啡酸、8-O-乙酰山梔苷甲酯、連翹酯苷B、木犀草苷、麥角甾苷峰面積RSD分別是0.69%，0.66%，1.4%，1.2%，0.81%，0.55%，1.1%，0.46%。表明獨一味供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 加樣回收率試驗 取同一供試品6份，每份約0.25g，精密稱定，分別精密加入70%甲醇溶液配制的各對照品溶液適量，按2.3項方法制備供試溶液并依法測定，計算加樣回收率，結(jié)果見表2。

2.9 樣品的測定 參考草地退化的分級標(biāo)準(zhǔn)[10]，根據(jù)植物群落結(jié)構(gòu)、土壤裸露程度將所調(diào)查獨一味樣地退化程度分為4級，分別為：極度退化草地、重度退化草地、中度退化草地、輕度退化草地。取獨一味樣品，按2.3項方法分別制備供試品溶液，平行2份，吸取供試品溶液2 μL，按 2.1 項色譜條件測定。計算樣品含量，結(jié)果見表3。

3 結(jié)果和討論

3.1 8種成分相關(guān)性分析 采用了SPSS 21.0軟件對8種成分的相關(guān)性進(jìn)行了分析，結(jié)果見表4。

分析結(jié)果表明，咖啡酸、綠原酸、連翹酯苷B、麥角甾苷、木犀草苷、胡麻屬苷之間體現(xiàn)出良好的正相關(guān)。其中前5種成分在其結(jié)構(gòu)中均含有對羥基桂皮酸母核，這類成分均為莽草酸合成途徑，說明這些成分受到的調(diào)控是一致的。

山梔苷甲酯與8-O-乙酰山梔苷甲酯含量呈顯著負(fù)相關(guān)，二者同為環(huán)烯醚萜類，前者環(huán)烯醚萜母核8位上乙?；吹煤笳?，二者含量呈此消彼長。

3.2 聚類分析與主成分分析 以獨一味8種成分含量為指標(biāo)，采用SPSS 21.0軟件對不同地區(qū)32批獨一味進(jìn)行相似性分析、聚類分析和主成分分析，其中，第一主成分主要反映了綠原酸、連翹酯苷B、咖啡酸、木犀草苷、麥角甾苷的信息，第二主成分主要反映了山梔苷甲酯的信息，見圖2。

結(jié)果顯示，獨一味中8種成分含量體現(xiàn)出一定產(chǎn)地特征。即相同產(chǎn)地或地理位置接近的樣品多聚成一類或主成分投影較為接近。如阿壩縣、久治縣樣品距離較近且在主成分投影中多投影在聚類圖的右側(cè)，瑪曲縣樣品聚集在投影圖的左側(cè)，而色達(dá)縣的樣品相對分散。

另一方面，隨草地退化程度加劇，各產(chǎn)地8種成分總量變化趨勢分別為：四川阿壩縣：輕度退化樣> 極度草甸樣>灌叢退化樣>中度退化樣；青海久治縣：極度退化樣>灌叢草甸樣>中度退化樣>重度退化樣；四川色達(dá)縣：中度退化樣>輕度退化樣>極度退化樣；甘肅瑪曲縣：輕度退化樣>極度退化樣>重度退化樣>正常草地樣。其中，四川阿壩縣不同退化梯度含量差異較小，四川色達(dá)和甘肅瑪曲在不同退化程度草地上的樣品含量差異顯著?？傮w而言，獨一味中8種成分含量與所在草地退化等級無相關(guān)性。endprint

3.3 不同產(chǎn)地成分含量比較 四川省阿壩縣、四川省色達(dá)縣、甘肅省瑪曲縣、青海省久治縣4個產(chǎn)地8種成分總含量的平均值，見表5。結(jié)果顯示，8種成分總含量以四川省阿壩縣樣品最高，青海省久治縣樣品與阿壩縣較接近，而甘肅省瑪曲縣樣品含量最低。

3.4 儲存時間對8種成分含量的影響分析 所有樣品均在采集當(dāng)年的2015年9月及儲存1年后的2016年9月分別進(jìn)行了測定，測定結(jié)果顯示的是貯存1年前后，所有樣品各成分含量總和，見表6。

結(jié)果表明，胡麻屬苷減少了23%，變化幅度最大，分析認(rèn)為胡麻屬苷結(jié)構(gòu)有環(huán)氧乙烷結(jié)構(gòu)，不穩(wěn)定，極易與親核試劑發(fā)生開環(huán)反應(yīng)，造成含量降低。山梔苷甲酯、綠原酸、8-O-乙酰山梔苷甲酯儲存1年以后稍有降低；連翹酯苷B、麥角甾苷儲存1年之后含量略有增加；木犀草苷儲存1年后含量變化不明顯。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 中國藥典.一部[S]. 2015.

[2] 白蓉，郭延偉.獨一味中苯乙醇苷提取物的鎮(zhèn)痛抗炎作用及毒性研究[J].華西藥學(xué)雜志，2015（3）：384.

[3] 魏剛，蔡慶群，黃月純，等.川芎飲片及其煎劑HPLC指紋圖譜的相關(guān)性研究[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2011（2）：46.

[4] 李隆云，占堆，衛(wèi)瑩芳，等.瀕危藏藥資源的保護(hù)[J].中國中藥雜志，2002，27（8）：4.

[5] 白蓉，郭延偉.獨一味中苯乙醇苷提取物的鎮(zhèn)痛抗炎作用及毒性研究[J].華西藥學(xué)雜志，2015（3）：384.

[6] 鄭亞男，杜文杰，尹雪霏，等.獨一味不同有效部位抗炎鎮(zhèn)痛作用比較[J].時珍國醫(yī)國藥，2015（2）：282.

[7] 朱斌，龔念，彭崇勝，等.獨一味鎮(zhèn)痛作用及其有效成分研究[J].中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志，2012（3）：442.

[8] 鐘世紅，古銳，王鈴鑫，等.HPLC同時測定獨一味中7種成分含量[J].中國中藥雜志，2014，39（22）：4373.

[9] 昝珂，焦興蘋，過立農(nóng)，等.藏藥獨一味及其偽品HPLC特征圖譜和4種成分含量測定[J].中國中藥雜志，2016，41（12）：2284.

[10] 任繼周.草業(yè)科學(xué)研究方法[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1998：42.

[責(zé)任編輯 丁廣治]endprint