樹莓葉果中水楊酸含量測定及其抑菌性分析

楊國慧+范婷婷+陳效杰+史影肖+呂孟杰+王昱文+趙珺祺+韓德果

摘要：為了解樹莓葉、果中水楊酸含量變化及其抑菌性能，采用高效液相色譜法測定6個(gè)不同樹莓品種不同生長時(shí)期和不同成熟度果實(shí)中的水楊酸含量，并以現(xiàn)保存菌種番茄灰霉病菌和大腸桿菌為材料分析其真菌、細(xì)菌抑菌性。結(jié)果表明，夏果型品種結(jié)果枝葉片水楊酸含量最高期出現(xiàn)在5月末，秋果型品種則出現(xiàn)在6月末，最高含量分別為2032、2.157 mg/g；樹莓果實(shí)成熟期水楊酸含量最高為1.390 mg/g；樹莓葉片和果實(shí)中水楊酸對(duì)番茄灰霉病菌和大腸桿菌的抑菌率最高分別為35.83%、81.72%。樹莓葉、果中水楊酸含量葉片高于果實(shí)，對(duì)大腸桿菌抑制效果強(qiáng)于番茄灰霉病菌的抑菌效果。

關(guān)鍵詞：樹莓；水楊酸含量；果實(shí)；葉片；抑菌性；高效液相色譜法

水楊酸（salicylic acid，簡稱SA）是植物體內(nèi)產(chǎn)生的簡單酚類化合物，作為精細(xì)有機(jī)合成中間體，可以用于香料、化妝品、防腐劑、配制動(dòng)物性香精等[5-8]；同時(shí)水楊酸具有消炎、抗風(fēng)濕、解熱止痛的功效，對(duì)青霉、灰霉、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等多種菌類具有抑制作用，為化工醫(yī)藥工業(yè)的重要原料[9-10]?，F(xiàn)有資料報(bào)道，樹莓葉片和果實(shí)中均含有豐富的水楊酸，含量可達(dá)1.434 mg/g[11-13]。但樹莓不同品種之間、同一品種不同生長時(shí)期葉片和不同成熟度果實(shí)中水楊酸含量存在多大差異，樹莓葉片和果實(shí)中水楊酸抑菌性如何，尚未有報(bào)道。

高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，簡稱HPLC）目前被廣泛用于檢測食品和藥品中的水楊酸含量。本研究以樹莓的不同品種為材料，利用高效液相色譜法，測定其不同發(fā)育時(shí)期葉片、不同成熟期果實(shí)中水楊酸的含量，并利用實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)保存菌種番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）和大腸桿菌（Escherichia coli）分析其抑菌效果，探討樹莓葉、果中水楊酸的生理活性性能，為今后樹莓葉、果的工業(yè)化利用提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

試驗(yàn)以黑龍江地區(qū)廣泛種植的三年生樹莓栽培品種為材料，采用夏果型品種：美22（American Twenty-two）、DNS22、費(fèi)爾杜德（Fertod Zamatos）；秋果型品種：秋福（Autumn Bliss）、金秋（Fall Gold）、哈瑞太茲（Heritage）。于2013年5、6、7、8、9月末分別采集上述品種結(jié)果枝成熟葉片以及不同成熟期（綠果期、轉(zhuǎn)白期、成熟期、過熟期）的果實(shí)，澆上液氮，-80 ℃保存?zhèn)溆肹14]。

1.2方法

1.2.1水楊酸的提取水楊酸提取參照張衛(wèi)等的方法[15]。具體過程如下：取葉1.0 g或果2.0 g，研磨勻漿，20 mL 90%甲醇，10 000 r/min離心30 min，重復(fù)2次，合并上清液，旋轉(zhuǎn)蒸干，15 mL 5%三氯乙酸加40 mL體積比1 ∶1乙酸乙酯 ∶環(huán)己烷混合液萃取2次，合并下層水相，15 mL 8 mol/L HCl密封，80 ℃ 恒溫水浴60 min，40 mL體積比1 ∶1乙酸乙酯 ∶環(huán)己烷混合液萃取2次，合并上層有機(jī)相，旋轉(zhuǎn)蒸干，30 mL 80%色譜級(jí)甲酸溶解，20%（0.2 mol/L，pH值為5.5）乙酸鈉定容，0.45 μm微孔過濾，濾液置于冰箱冷藏層保存。

1.2.2水楊酸含量的測定Waters2695色譜儀，色譜柱型號(hào)依利特SinoChrom C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）柱，流動(dòng)相甲醇、乙酸鈉（0.2 mol/L pH值為5.5）體積比6 ∶4混合液，進(jìn)樣 10 μL，流速0.5 mL/min，紫外吸收波長296 nm，水楊酸標(biāo)樣來自壇墨質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心，甲醇（色譜級(jí)）來自生工生物工程（上海）股份有限公司。

水楊酸的計(jì)算公式：

葉片y=30x/1 000；果實(shí)y=30x/2 000。

式中：x表示水楊酸濃度，μg/mL；y表示水楊酸含量，mg/g。

1.2.3水楊酸抑菌性分析使用實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)保存菌種，真菌為番茄灰霉病菌，細(xì)菌為大腸桿菌。真菌抑菌性分析采用十字交叉法，PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)，將6 mm菌餅接入60%水楊酸提取液抑菌平板的中央，26 ℃恒溫培養(yǎng)，5 d后調(diào)查菌落直徑；細(xì)菌抑菌性分析采用菌落計(jì)數(shù)法，將供試菌種接種到LB液體培養(yǎng)基中，置于搖床中于30 ℃培養(yǎng)48 h，稀釋107后吸取 200 μL 涂抹到制成的抑菌平板上，48 h后進(jìn)行菌落記數(shù)。上述試驗(yàn)均以加入60%甲醇的平板為對(duì)照，每個(gè)處理3次重復(fù)。

真菌抑菌率SA=[（A0-6）-（A1-6）/（A0-6）]×100%；細(xì)菌抑菌率SA=[（A0-A1）/A0]×100%。

式中：A0為空白對(duì)照（60%甲醇流動(dòng)相）真菌菌落直徑（mm）或細(xì)菌菌落數(shù)；A1為加入水楊酸提取液的真菌菌落直徑（mm）或細(xì)菌菌落數(shù)。

1.3數(shù)據(jù)分析

采用SPSS與Excel分析數(shù)據(jù)。

2結(jié)果與分析

2.1樹莓結(jié)果枝葉片不同時(shí)期水楊酸含量變化

美22、DNS22、費(fèi)爾杜德屬夏果型品種，結(jié)果后結(jié)果枝葉片易干枯脫落，因此美22、DNS22在9月末未采集到葉片，而費(fèi)爾杜德8月末就沒有采集到葉片。由圖1可見，夏果型樹莓3個(gè)品種美22、DNS22、費(fèi)爾杜德5月葉片水楊酸含量最高，3個(gè)品種含量高低表現(xiàn)為費(fèi)爾杜德

2.2不同成熟期樹莓果實(shí)中水楊酸含量的變化

圖2表明，樹莓果實(shí)中水楊酸含量和其成熟度有關(guān)：6個(gè)樹莓品種均隨著果實(shí)逐漸成熟，水楊酸含量逐步升高，成熟期達(dá)到最高值，而隨著過熟，含量又表現(xiàn)為降低。其中，哈瑞太茲成熟期水楊酸含量最高，為1.390 mg/g。6個(gè)樹莓品種果實(shí)的水楊酸含量變化趨勢一致，并沒有因?yàn)榉N類不同出現(xiàn)差異，出現(xiàn)高峰時(shí)期相同，均為成熟期。

2.3樹莓葉片和果實(shí)水楊酸含量比較

以6個(gè)樹莓品種葉片和果實(shí)中的水楊酸含量最高時(shí)期進(jìn)行比較，圖3表明，6個(gè)樹莓品種葉片中水楊酸含量均高于果實(shí)中的水楊酸含量，因此葉片中水楊酸含量并未因?yàn)槠贩N不同而不同。

2.4樹莓水楊酸提取液的抑菌能力

6個(gè)樹莓品種不同月份葉片和不同發(fā)育時(shí)期果實(shí)水楊酸提取液對(duì)番茄灰霉病菌和大腸桿菌均有一定的抑制作用，其中DNS22在5月末的葉片和哈瑞太茲在綠果期的果實(shí)中水楊酸提取液對(duì)番茄灰霉病抑菌率最高，抑菌率分別為 25.89%、35.83%（圖4、圖5）；金秋在8月末的葉片和轉(zhuǎn)白期的果實(shí)中水楊酸提取液對(duì)大腸桿菌抑菌率最高，抑菌率分別為81.72%、78.38%（圖6、圖7）。但不同品種、不同生長發(fā)育時(shí)期的果實(shí)和葉片水楊酸提取液對(duì)番茄灰霉病菌和大腸桿菌的抑制能力沒有和其水楊酸含量表現(xiàn)出一致的相關(guān)關(guān)系。

3結(jié)論與討論

試驗(yàn)中采用HPLC法測定樹莓葉片水楊酸含量在0.350～2.157 mg/g之間，果實(shí)中水楊酸含量為0.142～1.390 mg/g，且葉片中水楊酸含量高于果實(shí)中。年四輝等測得不同廠家板藍(lán)根藥材中的水楊酸含量，最高為 0.131 4 mg/g[16]；黃智鴻等測得不同時(shí)期榆錢中總水楊酸的含量最高為0.176 mg/g[17]；劉紹歡等測得不同地區(qū)透骨香中水楊酸最高含量為 0.205 mg/g[18]。和其他植物種類相比， 樹莓中的水楊酸含量

較高，尤其是樹莓葉片。

本研究結(jié)果中不同類型樹莓品種結(jié)果枝葉片中水楊酸含量高峰值出現(xiàn)時(shí)間不同：夏果型水楊酸5月含量最高，而秋果型品種水楊酸含量6月達(dá)到最大，這可能和不同類型品種的生長特性以及生產(chǎn)中采用的栽培措施有關(guān)。夏果型品種結(jié)果枝為二年生枝條，其上葉片萌發(fā)早，所以葉片水楊酸含量高峰期出現(xiàn)也早一些。果實(shí)成熟采摘后，結(jié)果枝上的葉片逐漸衰老、水楊酸含量顯著降低；秋果型品種一年生枝條為主要結(jié)果枝，春季萌芽前進(jìn)行平茬，葉片萌發(fā)較晚，水楊酸含量的高峰值出現(xiàn)時(shí)間也晚一些。嚴(yán)涵薇等采用HPLC法測定了5種玉米自交系玉米種水楊酸含量，顯示自交系間水楊酸含量大致相同，在1.36～1.51 μg/g之間[19]?？赡苡衩字兴畻钏醿H作為一種調(diào)節(jié)因子，微量即可調(diào)節(jié)植物生長。試驗(yàn)中同時(shí)測定了3種顏色不同果實(shí)（紅樹莓：費(fèi)爾杜德、秋福、哈瑞太茲；黃樹莓：DNS22、金秋；紫樹莓美22），發(fā)現(xiàn)水楊酸含量和果實(shí)色澤關(guān)系不大，主要和果實(shí)成熟度有關(guān)，成熟期果實(shí)含量最高。

水楊酸對(duì)真菌、細(xì)菌等具有一定的抑制作用。申曉慧等研究了水楊酸細(xì)菌金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和大腸桿菌的抑制作用，對(duì)3種菌抑制效果均表現(xiàn)明顯，且抑菌效果隨水楊酸濃度的增加而增強(qiáng)[20]。鄭國興等測得水楊酸對(duì)白色假絲酵母（Canidia albicans）、黑曲霉（Aspergillus nige）的抑菌率可分別達(dá)到75%、60%[21]。本研究結(jié)果顯示，樹莓葉片、果實(shí)提取液對(duì)真菌、細(xì)菌均有一定的抗性，最高分別達(dá)到35.83%、81.72%，對(duì)大腸桿菌抑制效果強(qiáng)于對(duì)番茄灰霉病菌的抑菌性。水楊酸HPLC法測定分析與抑菌性試驗(yàn)表明，樹莓水楊酸含量豐富，且葉片含量高于果實(shí)，6個(gè)樹莓品種中，哈瑞太茲綠果期果實(shí)和金秋8月末葉片提取水楊酸抑菌性較高，可以作為醫(yī)藥工業(yè)的理想原材料。

參考文獻(xiàn)：

[1]宣景宏，孟憲軍，劉春菊，等. 樹莓的主要功效成分及開發(fā)利用前景[J]. 中國果業(yè)信息，2007，24（1）：26-28.

[2]Kim M J，Sutton K L，Harris G K.Raspberries and related fruits[J]. Reference Module in Food Science，2016：586-591.

[3]黎慶濤，王遠(yuǎn)輝，王麗. 樹莓功能因子研究進(jìn)展[J]. 中國食品添加劑，2011（2）：172-177.

[4]Kumari P，Barman K，Patel V B，et al. Reducing postharvest pericarp browning and preserving health promoting compounds of litchi fruit by combination treatment of salicylic acid and chitosan[J]. Scientia Horticulturae，2015，197（14）：555-563.

[5]劉洪蛟，雷鳴，胡艷麗，等. HPLC法測定鏈莢豆根中水楊酸的含量[J]. 沈陽藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，30（5）：356-358.

[6]薛峰，林毅侃，馬躍龍，等. 食品中水楊酸含量測定方法的研究進(jìn)展[J]. 食品工業(yè)科技，2012，33（14）：429-431.

[7]董風(fēng)強(qiáng)，周國俊，蔣健，等. 高效液相色譜法測定香精香料中的水楊酸[J]. 廣州化工，2009，37（4）：139-140.

[8]季丹丹，劉艷紅，祝鈞. 化妝品用水楊酸酯類衍生物的制備及應(yīng)用進(jìn)展[J]. 日用化學(xué)工業(yè)，2015，45（11）：648-652.

[9]王若蘭，楊超，趙妍，等. 水楊酸處理對(duì)草莓采后品質(zhì)及灰霉病害的影響[J]. 河南工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，34（5）：24-28.

[10]葛暕，楊雙雙，陳全戰(zhàn)，等. 金屬-水楊酸及其衍生物的配合物的合成及抗真菌性能[J]. 生物學(xué)通報(bào)，2013，48（6）：50-54.

[11]Mullen W，Yokota T，Lean M E J，et al. Analysis of ellagitannins and conjugates of ellagic acid and quercetin in raspberry fruits by LC-MSn[J]. Phytochemistry，2003，64（2）：617-624.

[12]杜龍飛，李潔，楊龍，等. 覆盆子的化學(xué)成分研究[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2014，26：1957-1960.

[13]趙偉偉，李愛民，張正，等. 海蓬蘽懸鉤子水楊酸提取工藝及含量變化研究[J]. 北方園藝，2014（16）：127-130.

[14]葛秋來. 樹莓果實(shí)成熟軟化機(jī)理的初步研究[D]. 哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013.

[15]張衛(wèi)，孫國新，徐玉新，等. 植物體內(nèi)水楊酸分析方法的探討及其應(yīng)用[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報(bào)，2009，4（6）：889-897.

[16]年四輝，李萍，劉麗敏，等. HPLC測定板藍(lán)根及其制劑中水楊酸、苯甲酸的含量[J]. 中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012，18（21）：92-95.

[17]黃智鴻，史寶林，高寶嘉. HPLC測定榆錢中水楊酸的含量[J]，中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)志，2014，20 （16）：112-114.

[18]劉紹歡，梁光平，漆珍珍，等. 不同產(chǎn)地透骨香葉揮發(fā)油中水楊酸甲酯的含量測定[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（30）：18498-18500.

[19]嚴(yán)涵薇，朱蘇文，江海洋. HPLC法分析玉米自交系水楊酸含量[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（22）：11710-11711，11718.

[20]申曉慧，姜成. 水楊酸對(duì)食品中常見污染細(xì)菌的抑制作用研究[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2009，25（9）：55-57.

[21]鄭國興，張春樂，黃浩，等. 水楊酸的抑酶與抑菌作用[J]. 廈門大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，45（5）：19-22.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)2017年第45卷第23期薩如拉，陳建興，春花，等. 利用高壓熱水法提取厚樸的有效精油成分[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，45（23）：184-187.endprint