白鶴芋花序體細胞胚胎發(fā)生誘導(dǎo)研究

張桂芳+劉靜+劉春+張黎

摘要：以白鶴芋的花序為外植體，研究不同外源激素濃度、外植體的不同發(fā)育時期、花序取材部位及不同光周期培養(yǎng)條件對花序體細胞胚誘導(dǎo)的影響，擬篩選出體胚誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基配方及培養(yǎng)條件。結(jié)果表明，最優(yōu)白鶴芋花序體胚誘導(dǎo)方案如下：以白鶴芋盛花期花序為外植體，用0.1%氯化汞溶液滅菌10 min，接種于MS+5.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L TDZ+0.1 mg/L NAA培養(yǎng)基中，黑暗培養(yǎng)15 d后轉(zhuǎn)到光—暗周期為12 h—12 h的條件下培養(yǎng)。

關(guān)鍵詞：白鶴芋；花序；體細胞胚；體胚誘導(dǎo)

中圖分類號： Q945.51文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2017）23-0038-03

收稿日期：2016-07-06

基金項目：寧夏科技支撐計劃項目子課題（編號：GIP201648）。

作者簡介：張桂芳（1988—），女，山西大同人，碩士研究生，主要從事觀賞植物研究。E-mail：544406790@qq.com。

通信作者：張黎，教授，主要從事觀賞園藝研究。E-mail：zhang_li9988@163.com。白鶴芋（Spathiphylium）別稱苞葉芋、白掌、和平芋，為天南星科白鶴芋屬多年生草本花卉。白鶴芋廣泛應(yīng)用于盆栽觀賞，被視為“清白之花”，有純潔、安泰、一帆風(fēng)順之意[1]，是理想的花葉兼賞花卉，深受廣大消費者的喜愛，其市場需求量逐年增加，白鶴芋主要通過組織快繁技術(shù)來滿足其市場需求。體細胞胚胎繁殖技術(shù)是組織培養(yǎng)中一種高效的快繁技術(shù)，對于白鶴芋的組織培養(yǎng)，多集中在其器官發(fā)生，關(guān)于其體胚誘導(dǎo)的研究較少，最早的是周麗儂等于1995年對花序體胚再生途徑的研究[2]。本試驗以白鶴芋花序為外植體，研究花序取材時期、取材部位及激素濃度等對體胚誘導(dǎo)的影響，以期為白鶴芋的體胚誘導(dǎo)提供依據(jù)。

1材料與方法1.1試驗材料

以白鶴芋品種美酒的花序為外植體材料，取自寧夏銀川市寧夏園藝產(chǎn)業(yè)園。

1.2試驗方法

1.2.1不同發(fā)育時期白鶴芋花序滅菌處理試驗設(shè)不同白鶴芋花序發(fā)育時期的處理，分別為花苞期（即初花期，佛焰苞被完全包裹）（圖1-A）、盛花期（佛焰苞完全開放）（圖1-B）、末花期（佛焰苞及花序轉(zhuǎn)為綠色）（圖1-C）。將外植體用自來水沖洗30～60 min后，用75%乙醇處理30 s，然后用無菌水沖洗2～3遍，再然后用0.1% HgCl2溶液分別處理8、10、12 min，最后用無菌水沖洗2～3遍。將處理后的花序接種于不添加激素的MS培養(yǎng)基中，每個處理設(shè)20個外植體，試驗重復(fù)3次。接種20 d后，統(tǒng)計污染率，30 d后統(tǒng)計褐變率、無菌體獲得率。

1.2.2白鶴芋花序體細胞胚胎誘導(dǎo)試驗白鶴芋體細胞胚胎的誘導(dǎo)培養(yǎng)基選擇6-芐氨基腺嘌呤（6-BA）、噻苯?。═DZ）和萘乙酸（NAA）3種激素，設(shè)3個水平（表1）進行正交試驗，共9個處理（表2），每個處理20瓶，試驗重復(fù)3次。以MS為基本培養(yǎng)基，附加30 g/L蔗糖，6 g/L瓊脂，pH值58。將滅菌后成活的花序橫切為1.0～1.5 mm的薄片，接種于培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，每瓶接種5個。培養(yǎng)50 d后，統(tǒng)計體胚誘導(dǎo)率及體胚的生長情況。

1.2.4光周期對花序體胚的誘導(dǎo)試驗在不同光周期條件下進行體胚誘導(dǎo)試驗，設(shè)3種方式：T1處理，黑暗條件下培養(yǎng)15 d后，轉(zhuǎn)到光—暗周期為12 h—12 h的條件下培養(yǎng)；T2處理，始終在光—暗周期為12 h—12 h的條件下培養(yǎng)；T3處理，全暗條件下培養(yǎng)。在確定最佳體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基后，將花序接種到最佳體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)20、30、40、50、60 d后觀察并統(tǒng)計褐變率、誘導(dǎo)率。每個處理20瓶，重復(fù)3次。

1.2.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計及處理相關(guān)公式如下：

污染率=（污染的花序數(shù)/接種的花序外植體總數(shù)）×100%；

褐變率=（發(fā)生褐變的花序數(shù)/接種的花序外植體總數(shù)）×100%；

無菌花序獲得率=[（接種的花序總數(shù)-污染的花序數(shù)-死亡的花序數(shù)）/接種的花序外植體總數(shù)]×100%；

體胚誘導(dǎo)率=（生成初級體胚花序數(shù)/接種的花序外植體總數(shù)）×100%。

采用DPS軟件對數(shù)據(jù)進行處理，采用Duncans新復(fù)極差法進行多重比較。

2結(jié)果與分析

2.1滅菌處理對不同發(fā)育時期白鶴芋花序污染率的影響

用0.1% HgCl2溶液對白鶴芋花苞期、盛花期、末花期花序進行不同時間的滅菌試驗。如表3所示，當花苞期的滅菌時間為8 min時，無菌花序獲得率最高，為50.34%。盛花期花序在滅菌時間為10 min的處理下，污染率為26.67%，無菌花序獲得率達64.44%，即最適宜的滅菌時間為10 min。末花期最適宜的滅菌時間為12 min，其無菌花序獲得率達4778%。各個花期的褐變率都隨著滅菌時間的增加而提高，且在相同的滅菌時間下，褐變率排序為花苞期>盛花期>末花期。綜合比較褐變率和無菌花序獲得率可知，盛花期在最適宜的滅菌時間下，無菌花序獲得率最高，花苞期次之。

2.2不同激素濃度對初級體細胞胚直接誘導(dǎo)的影響

在初級體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)過程中，9個處理的培養(yǎng)基都能誘導(dǎo)初級體胚的產(chǎn)生，但不同培養(yǎng)基中的初級體胚誘導(dǎo)率差異較大。處理1、處理2、處理3培養(yǎng)基中的花序在培養(yǎng)40 d后大部分都出現(xiàn)褐化及死亡的情況，只有極少部分花序能產(chǎn)生微小的黃綠色顆粒狀突起。隨著6-BA濃度的增加，處理 4至處理9在培養(yǎng)10 d后白色的花序均逐漸轉(zhuǎn)為綠色，并膨大。培養(yǎng)50 d后花序膨大至原來的2倍，處理4、處理5、處理6表面產(chǎn)生少量的黃綠色體胚，處理8花序表面形成大量緊密的簇狀體細胞胚。在解剖鏡下觀察，可清晰地看到黃綠色的球形胚（圖2-B）、梨形胚（圖2-C）、子葉形胚（圖2-D）和成熟體胚（圖2-E），在同一個花序上能觀察到不同發(fā)育時期的體胚（圖2-A）。endprint

9個處理間差異都極顯著，由K值和誘導(dǎo)率可知，處理8為白鶴芋花序初級體細胞胚誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基，激素組合為5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L TDZ+0.1 mg/L NAA。由極差R可知，6-BA 對白鶴芋花序初級體胚誘導(dǎo)的影響最大，遠大于TDZ、NAA，3種激素對初級體胚誘導(dǎo)效應(yīng)大小依次為 6-BA>TDZ>NAA（表4）。

2.3白鶴芋花序不同發(fā)育時期、不同取材部位對初級體細胞胚誘導(dǎo)的影響

由表5可以看出，花序體胚誘導(dǎo)率與發(fā)育時期、取材部位具有一定的相關(guān)性，體胚誘導(dǎo)率排序為盛花期>初花期>末花期，且盛花期體胚的誘導(dǎo)率明顯高于其他時期。同時期同花序的不同形態(tài)位置對體胚誘導(dǎo)有顯著影響，表現(xiàn)為花序下端>花序上端>花序中端。其中盛花期花序形態(tài)學(xué)下端的誘導(dǎo)率最高，達71.67%，且與其他處理差異極顯著。綜合體胚

2.4光周期變化對體細胞胚誘導(dǎo)的影響

由表6可知，3個處理均能誘導(dǎo)出體細胞胚，但各處理間差異顯著。T1、T2處理較T3處理誘導(dǎo)率高， 生成體細胞胚數(shù)

量多。但在T3處理培養(yǎng)條件下，褐變率較T1、T2處理低。花序體細胞胚的誘導(dǎo)在黑暗培養(yǎng)條件下較光照條件下晚，60 d時，花序在光—暗條件下的胚誘導(dǎo)率比在全黑暗培養(yǎng)下的體胚誘導(dǎo)率提高了20%以上。在體胚發(fā)育過程中觀察發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)至20 d時部分花序上生成顆粒狀突起，隨著培養(yǎng)時間增加，顆粒狀突起逐漸膨大。當培養(yǎng)到60 d時，T2處理體胚呈淡綠色略顯褐色，T3處理體胚呈黃白色，T1處理體胚呈黃綠色，隨著培養(yǎng)時間的增加，T1處理體胚顏色逐漸變綠，且最為健康。因此可以得出，T1處理是體胚誘導(dǎo)最佳的光周期變化。

3結(jié)論與討論

3.1結(jié)論

對于不同發(fā)育時期的白鶴芋花序，用0.1%氯化汞溶液進行滅菌處理可知，花苞期最佳滅菌時間為8 min，盛花期最佳滅菌時間為10 min，末花期最佳滅菌時間為12 min。在最佳滅菌時間下，無菌花序獲得率由高到低依次為盛花期>花苞期>末花期。

白鶴芋花序體胚誘導(dǎo)的各激素效應(yīng)大小依次為6-BA>TDZ>NAA，其中6-BA的影響最顯著。9個處理的培養(yǎng)基中，體胚誘導(dǎo)率差異較大，花序初級體細胞胚誘導(dǎo)最優(yōu)激素組合為 5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L TDZ+0.1 mg/L NAA。

盛花期的花序為最佳體胚誘導(dǎo)外植體，而且以盛花期的形態(tài)學(xué)下端的體胚誘導(dǎo)率最高。黑暗下培養(yǎng)15 d后轉(zhuǎn)到光—暗周期為12 h—12 h條件下培養(yǎng)為白鶴芋花序初級體胚誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)條件。

3.2討論

同一植物的不同發(fā)育時期及不同部位對外植體的滅菌效果具有一定的影響。高亦珂在試驗中指出，百合鱗莖、鱗片滅菌效果排序依次為內(nèi)部>中部>外部[3]。百合內(nèi)部和中部鱗片被包裹，受到外界環(huán)境的污染小，因此滅菌效果較好。本研究在對白鶴芋不同發(fā)育時期花序進行滅菌處理試驗中發(fā)現(xiàn)，白鶴芋花序的花苞期、盛花期的滅菌效果比末花期滅菌效果好。這是因為花苞期的花序軸被苞片包裹，盛花期的花序苞片展開時間不長，受外界環(huán)境影響程度小，而末花期的花序軸完全暴露，受外界環(huán)境影響大，易受損傷和受到細菌的侵染，滅菌難，污染率高。

在白鶴芋體細胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)中，MS培養(yǎng)基只保證白鶴芋花序的生存，只有生長素及細胞分裂素濃度適宜的配比，才能誘導(dǎo)產(chǎn)生形態(tài)正常、數(shù)量多的體細胞胚。體胚的誘導(dǎo)通常需要較高濃度的細胞分裂素和較低濃度的生長素或不需要生長素[4-5]。周麗儂等研究認為，含有高濃度6-BA的培養(yǎng)基有利于白鶴芋花序體細胞胚的直接誘導(dǎo)[2]。曹靜等通過研究得出，白鶴芋幼嫩花序培養(yǎng)在MS+4～5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA的培養(yǎng)基中，由花序表面直接發(fā)生體細胞胚胎[6]。鄺哲師等研究發(fā)現(xiàn)，高濃度的6-BA有利于提高香蕉花序體胚直接發(fā)生頻率[7]。呂秀立等研究表明，誘導(dǎo)歐洲七葉樹體細胞胚產(chǎn)生的最佳培養(yǎng)是8 mg/L 6-BA+1 mg/L NAA+2 mg/L 2，4-D+0.2 mg/L KT[8]。白鶴芋花序直接體胚誘導(dǎo)率與發(fā)育時期、取材部位具有一定的相關(guān)性。穆紅梅等以中國石蒜花苞期、盛花期、落花期的花序軸為外植體進行組織培養(yǎng)研究表明，花序在不同發(fā)育時期對中國石蒜不定芽產(chǎn)生有顯著影響，盛花期產(chǎn)生的花序軸不定芽數(shù)量最多[9]。王麗等在對香雪蘭花序直接體細胞胚胎發(fā)生的試驗中發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)產(chǎn)生的體細胞胚都出現(xiàn)在花序軸切段的原形態(tài)學(xué)下端。上述研究結(jié)果與本試驗一致[10]。光周期的不同對胚狀體形成有顯著影響，在每天光照14～16 h與黑暗8 h～10 h交替條件下體胚直接誘導(dǎo)效果最佳[11]。鄺哲師等研究發(fā)現(xiàn)，黑暗培養(yǎng)對香蕉體胚直接發(fā)生有促進作用，黑暗條件抑制了外植體本身酚類物質(zhì)的氧化，減少了醌類物質(zhì)形成產(chǎn)生的毒害[7]。

范國強等研究表明，懸鈴木外植體在黑暗條件下培養(yǎng)3 d后，再放置在光照時間為16 h/d的條件下培養(yǎng)，不僅可以促進懸鈴木體細胞胚胎的發(fā)生，而且提高了體胚誘導(dǎo)率[12]，與本試驗結(jié)果一致。

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