江西古桑樹(shù)桑葉中活性成分含量的測(cè)定

黃金枝 俞燕芳 杜賢明 鄧真華

(江西省蠶桑茶葉研究所 330202)

我國(guó)自古就有栽桑養(yǎng)蠶的傳統(tǒng)，全國(guó)各地遺留下來(lái)的古桑樹(shù)是我國(guó)栽桑養(yǎng)蠶的活化石。由于自然和人為原因，這些古桑樹(shù)的生存現(xiàn)狀不容樂(lè)觀，目前幸存的千年古桑樹(shù)已為數(shù)不多。這些經(jīng)歷千年風(fēng)霜的古桑樹(shù)，不僅彰顯了我國(guó)是栽桑養(yǎng)蠶的發(fā)源地，且給世人留下了觀賞古桑樹(shù)風(fēng)貌的機(jī)遇，同時(shí)這些上千年、數(shù)百年的古桑樹(shù)也給我們留下了很多動(dòng)人的傳說(shuō)[1]。近年來(lái)江西省蠶桑茶葉研究所經(jīng)多方咨詢(xún)考察，發(fā)現(xiàn)江西省古桑樹(shù)資源分布較多地方為吉安地區(qū)。

桑葉的主要成分除水分以外，還含有豐富的蛋白質(zhì)、碳水化合物、 無(wú)機(jī)鹽、維生素以及人體所需的多種微量元素，具有降血壓、降血脂、抗衰老、增加耐力、降低膽固醇、抑制腸內(nèi)有害細(xì)菌繁殖和過(guò)氧化物產(chǎn)生等獨(dú)特的功效，對(duì)人體有良好的保健作用[2]。桑葉中含有黃酮及其苷、生物堿、多糖、揮發(fā)油、各種氨基酸、微量元素等[3]，成分比較復(fù)雜，黃酮類(lèi)成分是主要有效成分之一[4]。桑葉黃酮具有抗衰老作用[5]和抑菌活性[6]，生物堿類(lèi)中主要的功效成分1-脫氧野尻霉素是α-葡萄糖甘酶抑制劑，具有降血糖、抗病毒、抗氧化、抗腫瘤轉(zhuǎn)移等多種生物活性。本文以吉安地區(qū)生長(zhǎng)的古桑樹(shù)桑葉為試驗(yàn)材料，分析測(cè)定其桑葉中的總酚、總黃酮、DNJ和多酚單體的含量，以期為功能性成分桑品種的選育和品種評(píng)價(jià)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料的基本情況

根據(jù)北京古樹(shù)名木評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)(DB11/T478-2007)，胸徑≥100，分級(jí)級(jí)別為一級(jí)，胸徑≥50cm，分級(jí)級(jí)別為二級(jí)。

供試桑品種均采自于江西省吉安地區(qū)，其性狀見(jiàn)表1。由表1可知，試驗(yàn)桑樹(shù)的樣品均為古桑樹(shù)，其中葉1號(hào)樹(shù)為一級(jí)，其它為二級(jí)。

表1 吉安地區(qū)古?；拘誀钫{(diào)查表

1.2 試驗(yàn)方法與設(shè)備

新鮮桑葉于60℃烘干至恒重，粉碎過(guò)60目篩，備用。測(cè)定時(shí)準(zhǔn)確稱(chēng)取一定重量，重復(fù)取3次，用于桑葉活性成分含量測(cè)定。

設(shè)備：Agilent 1260高效液相色譜(美國(guó)安捷倫科技公司)、722型分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 總酚含量測(cè)定

稱(chēng)取不同古桑桑葉樣品，置50mL離心管中，加80%乙醇30mL，超聲提取3次，每次30min。10 000rpm離心5min，合并提取液，過(guò)濾并轉(zhuǎn)入100mL容量瓶中，以80%乙醇定容，即得待測(cè)桑葉總酚的供試品。測(cè)定方法采用福林-肖卡法[7～8]，以沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算總酚類(lèi)物質(zhì)的含量。

1.3.2 總黃酮含量測(cè)定

提取方法同1.3.1。測(cè)定方法采用亞硝酸鈉-硝酸鋁法，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算總黃酮含量[2]。

1.3.3 DNJ含量測(cè)定

稱(chēng)取0.1g干燥至恒重的桑葉粉末，精密稱(chēng)定，于10mL的離心管中，加0.05mol/L的鹽酸溶液10mL，渦旋提取3min，離心15min(轉(zhuǎn)速12 000r/min)，取上清液，殘?jiān)?.05mol/L的鹽酸溶液10mL,同法重復(fù)提取一次，離心，合并2次提取液并轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶，蒸餾水定容即得待測(cè)的供試品。

準(zhǔn)確稱(chēng)取20mgDNJ標(biāo)準(zhǔn)品于25mL容量瓶中，加超純水溶解并定容，即得0.8g/L的DNJ標(biāo)準(zhǔn)溶液，稀釋至質(zhì)量濃度為60μg/mL、120μg/mL、180μg/mL、240μg/mL、300μg/mL、480μg/mL備用。以DNJ的質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)，吸光度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得DNJ的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)線(xiàn)性回歸方程。

取DNJ提取液(或DNJ標(biāo)準(zhǔn)液)100μL，再加入5mmol/L的FMOC-Cl(溶解于乙腈中)200μL，混勻后于25℃水浴20min。加入1mol/L甘氨酸100μL中和剩余的FMOC-Cl以終止反應(yīng)，加入1%醋酸100μL及超純水400μL，以0.45μm微孔濾膜過(guò)濾器過(guò)濾，收集濾液備測(cè)?？瞻讓?duì)照以蒸餾水代替DNJ提取液進(jìn)行衍生化反應(yīng)。

色譜條件：色譜柱C18柱(150mm×4.6mm×5μm)；熒光檢測(cè)器激發(fā)波長(zhǎng)254nm，發(fā)射波長(zhǎng)322nm；流動(dòng)相為乙腈-0.1%醋酸(體積比50:50)；流速1.0mL/min；柱溫25℃；進(jìn)樣量10μL。

1.3.4 多酚單體含量測(cè)定

提取方法同1.3.1。色譜柱：ZORBAX SB-C18柱(4.6mm×250mm，5μm)，流動(dòng)相A-乙腈、B-0.4%冰醋酸，流速1.0mL/min，柱溫30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)280nm。梯度洗脫程序：B泵在0～40min時(shí)，95%降至75%；在40～45min時(shí)，由75%降至65%；在45～50min時(shí)，由65%降至50%[9]。

標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制備：準(zhǔn)確稱(chēng)取綠原酸、蘆丁、槲皮素和龍膽酸標(biāo)樣各0.0100g，用純甲醇定容至10mL，4℃保存?zhèn)錅y(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同古桑樹(shù)桑葉中總酚含量的變化

根據(jù)實(shí)驗(yàn)方法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，回歸方程式 y =3.7434x+0.0525，R2=0.9973，表明沒(méi)食子酸質(zhì)量濃度為0.02～0.2mg/mL范圍內(nèi)與其吸光值呈現(xiàn)良好的線(xiàn)性關(guān)系，符合朗伯比爾定律，該方程可用于桑葉總酚的定量測(cè)定。不同桑葉總酚含量的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖1，由圖1可知不同桑葉總酚含量存在差異，葉2和葉3差異不顯著(p>0.05)，葉1、葉4、葉5和葉6差異極顯著(p<0.01)，其中葉6中總酚含量最高，均值高達(dá)18.31mg/g，葉4次之，均值為17.39mg/g，葉2含量最低，均值為13.16mg/g。

圖1 不同古桑樹(shù)桑葉中總酚含量的變化

2.2 不同古桑樹(shù)桑葉中總黃酮含量的變化

根據(jù)實(shí)驗(yàn)方法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，回歸方程式 y =1.4586x-0.0167，R2=0.999，表明蘆丁質(zhì)量濃度為0.1 ～0.6mg/mL范圍內(nèi)與其吸光值呈現(xiàn)良好的線(xiàn)性關(guān)系，符合朗伯比爾定律，該方程可用于桑葉總黃酮的定量測(cè)定。不同桑葉總黃酮含量的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)

圖2，由圖2可知不同桑葉總黃酮含量存在差異，葉1、葉2和葉5差異不顯著(p>0.05)，葉3、葉4和葉6差異極顯著(p<0.01)，其中葉4中總黃酮含量最高，均值高達(dá)35.24mg/g，葉6次之，均值為31.68mg/g，葉3含量最低，均值為25.59mg/g。

圖2 不同古桑樹(shù)桑葉中總黃酮含量的變化

2.3 不同古桑樹(shù)桑葉中DNJ含量的變化

根據(jù)實(shí)驗(yàn)方法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，回歸方程式 y =0.1557x+1.8258，R2=0.9952，x軸代表峰面積，y軸代表濃度，表明DNJ質(zhì)量濃度為11.2 ～56μg/mL范圍內(nèi)與其峰面積呈現(xiàn)良好的線(xiàn)性關(guān)系，符合朗伯比爾定律，該方程可用于桑葉DNJ的定量測(cè)定。不同古桑樹(shù)桑葉DNJ含量的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖3，由圖3可知，品種不同DNJ含量存在很大的差異。葉1樣的DNJ含量最高，高達(dá)8.63mg/g，是葉5樣的10倍。從DNJ含量角度考慮，可以把葉1樣株作為特殊種質(zhì)資源加以保存。

圖3 不同古桑樹(shù)桑葉中DNJ含量的變化

2.4 不同古桑樹(shù)桑葉中多酚單體含量的變化

2.4.1液相色譜標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備

在確定的色譜條件下測(cè)定不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)品混合液，以各梯度質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)，峰面積為橫坐標(biāo)，得到各類(lèi)多酚單體的回歸方程(表1)。各標(biāo)樣質(zhì)量濃度與峰面積的相關(guān)性良好，相關(guān)系數(shù)(R2)在0.9994以上。

2.4.2 不同古桑樹(shù)桑葉中多酚單體物質(zhì)色譜圖

不同古桑樹(shù)桑葉中多酚單體色譜圖見(jiàn)圖4。由圖4可以看出，不同古桑樹(shù)桑葉中多酚單體物質(zhì)得到了較好的分離，且圖譜相似，共有峰較多。

2.4.3 不同古桑樹(shù)桑葉中多酚單體物質(zhì)含量變化

不同古桑樹(shù)桑葉多酚單體含量的變化見(jiàn)表2。由表2可知，葉6中綠原酸含量最高，為11.47mg/g，不同古桑樹(shù)桑葉之間綠原酸含量大小關(guān)系：葉6>葉4>葉5>葉1>葉2>葉3；葉5中蘆丁含量最高，為1.99mg/g，不同古桑樹(shù)桑葉之間蘆丁含量的高低關(guān)系：葉5>葉6>葉4>葉1>葉3>葉2；葉6中槲皮素含量最高，為0.60mg/g，不同古桑樹(shù)桑葉之間槲皮素含量高低關(guān)系：葉6>葉4>葉5>葉1>葉2>葉3；葉6中龍膽酸含量最高，為2.12mg/g，不同古桑樹(shù)桑葉之間龍膽酸含量順序：葉6>葉4>葉5>葉1>葉3>葉2。綜合來(lái)看葉6中多酚單體含量相對(duì)較高。

表1 4種多酚單體物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

表2 不同古桑樹(shù)桑葉中多酚單體物質(zhì)含量變化

圖4 不同古桑樹(shù)桑葉中多酚單體液相色譜圖

3 小結(jié)與討論

通過(guò)對(duì)6株古桑樹(shù)桑葉總黃酮含量進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)不同株的古桑樹(shù)桑葉總黃酮含量差異顯著。不同地方、不同樹(shù)齡的古桑樹(shù)，其桑葉多酚含量存在差異，有的還達(dá)到極顯著水平。不同株的古桑樹(shù)桑葉DNJ含量也存在很大的差異，葉1樣的DNJ含量最高，高達(dá)8.63mg/g，是葉5樣的10倍。從DNJ含量角度考慮，可以把葉1號(hào)樣株作為特殊種質(zhì)資源加以保存。

不同桑葉營(yíng)養(yǎng)成分含量上的差異除了受本身遺傳和生理特性影響外，還受栽培地區(qū)氣候、土壤和栽培條件的影響，桑葉作為一種藥食兩用的植物，評(píng)價(jià)其營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)好壞的指標(biāo)有很多，包括蛋白、脂肪、多糖、總酸、纖維、多酚、黃酮等，但根據(jù)其用途的不同，營(yíng)養(yǎng)評(píng)價(jià)指標(biāo)也有所不同。因而在營(yíng)養(yǎng)評(píng)價(jià)上要有選擇性，做到有的放矢，物盡其用[10]。

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