噬菌體裂解酶作用機制及用于細菌感染治療的研究進展

朱 丹，祝思路，付玉榮，伊正君

(濰坊醫(yī)學院 1.醫(yī)學檢驗學系; 2.臨床醫(yī)學院， 山東 濰坊 261053)

噬菌體是感染細菌、真菌、放線菌或螺旋體等微生物的病毒，侵入細菌細胞內(nèi)并產(chǎn)生酶破壞細胞壁從而裂解細菌。噬菌體分為溫和噬菌體和烈性噬菌體。前者是感染細菌后不增殖、不裂解細菌，而是將其核酸整合到細菌染色體上，并能與染色體一起復制傳代。后者是在宿主細胞內(nèi)復制增殖，產(chǎn)生許多子代噬菌體并控制編碼裂解酶(endolysin)最終使細菌裂解，也稱毒性噬菌體，因為其可以產(chǎn)生裂解酶裂解細菌,所以對臨床有利用和研究價值。

1 裂解細菌的機制

噬菌體分為雙鏈DNA噬菌體和單鏈RNA噬菌體，裂解酶大多是雙鏈DNA噬菌體編碼的，一般在病毒復制晚期合成的一類胞壁質(zhì)水解酶。具有底物特異性和高效性。根據(jù)作用于細胞壁肽聚糖共價鍵位點的不同，可將噬菌體裂解酶分為葡糖苷酶、酰胺酶、內(nèi)肽酶和轉(zhuǎn)糖基酶。具有酰胺酶活性的裂解酶的裂菌譜(split bacterial spectrum)較寬[1]。裂解酶的高親和性與種屬特異性的細胞壁糖基有關(guān)，而后者是細菌存活的必要成分，所以細菌難以對裂解酶產(chǎn)生抗性，自然界中，幾乎所有的細菌都有相應(yīng)的噬菌體，所以裂解酶的開發(fā)研究具有重要的價值。

噬菌體裂解酶裂解細菌的方式有“自內(nèi)裂解”(lysis from interior)和“自外裂解”(lysis from external)兩種方式。當有噬菌體存在時，噬菌體侵入細菌并編碼產(chǎn)生裂解酶，從細菌內(nèi)部裂解細菌的方式即“自內(nèi)裂解”。當沒有噬菌體時，將某些噬菌體裂解酶放至對其敏感的細菌中，噬菌體裂解酶也可以在細菌外發(fā)揮有效的裂解作用，即“自外裂解”[2]。噬菌體“自內(nèi)裂解”細菌通常是裂解酶與穴蛋白(holin)這2種物質(zhì)導致細菌裂解的，裂解酶主要靶向作用于細胞壁，穴蛋白主要靶向作用于細胞膜。

1.1 靶向細胞壁

許多噬菌體裂解酶都具有“雙結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)”的特點，即N-端結(jié)構(gòu)域具有催化活性，可以特異的切斷肽聚糖(peptidoglycan，PG)的化學鍵，也稱催化域(catalytic domain)[3]。催化域中含有5種主要類型的酶活性：N-乙酰胞壁酶、內(nèi)-b-N-乙酰氨基葡糖苷酶、轉(zhuǎn)糖苷酶、N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶或者內(nèi)肽酶。大部分的催化結(jié)構(gòu)域是作用于胞壁上的聚糖骨架或多肽鏈之間的酰胺鍵，還有少部分比如分支桿菌噬菌體裂解酶作用于肽聚糖。C-端結(jié)構(gòu)域是與宿主細胞壁上的特異性底物結(jié)合的區(qū)域，胞壁上含有多糖和磷壁酸受體[4]。少數(shù)噬菌體具有其他結(jié)構(gòu)的裂解酶，這些噬菌體裂解酶含有多個不同的催化結(jié)構(gòu)域和一個結(jié)合結(jié)構(gòu)域。其中催化結(jié)構(gòu)域維持著酶的宿主特異性，結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)Ρ３置傅耐暾苑浅Ｖ匾猍5]。

1.2 靶向細胞膜

雙鏈DNA基因組的噬菌體控制編碼的裂解酶有利于溶解細胞壁的肽聚糖，但裂解酶不含信號序列不能通過細胞質(zhì)膜，需要穴蛋白的協(xié)助[6]。穴蛋白是細胞的溶解效應(yīng)器[7]，由105個氨基酸組成，能夠透細胞膜并起到信號肽的作用，在細胞膜上打孔破壞細胞膜的內(nèi)外滲透壓和正常調(diào)節(jié)機制，使細胞膜破裂內(nèi)容物外漏崩解。小RNA噬菌體編碼的單一蛋白質(zhì)稱為amurins[8]，這個蛋白有導致細胞膜溶解并抑制細胞壁合成的作用，一般不需要穴蛋白協(xié)助。

所以溶菌效應(yīng)是穴蛋白和裂解酶協(xié)同作用的結(jié)果。在裂解循環(huán)的末端，通過穴蛋白寡聚化(oligomerization)誘導細胞質(zhì)膜的損傷，隨之裂解酶分解肽聚糖,通過溶解細胞壁造成細胞的裂解來釋放子代噬菌體[9]。

圖1 自內(nèi)裂解Fig 1 Lysis from interior

圖2 自外裂解Fig 2 Lysis from external

2 裂解細菌的特性

2.1 裂解酶具有特異性

裂解酶只裂解其宿主菌，對其他菌株沒有殺滅作用，鮑曼不動桿菌噬菌體裂解酶PlyAB1，只裂解鮑曼不動桿菌，對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌均沒有裂解作用[10]。通過基因重組技術(shù)得到的針對產(chǎn)氣莢膜梭菌的裂解酶，將其置于含產(chǎn)氣莢膜梭菌和其他菌株的培養(yǎng)基中進行濁度減少試驗，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)氣莢膜梭菌被裂解，但沒有裂解任何產(chǎn)氣莢膜梭菌以外的菌種[11]。作為1種抗菌藥，裂解酶的特異性可以有效的避免菌群失調(diào)的發(fā)生。

2.2 裂解酶具有高效性

裂解酶與抗生素相比有較強的殺菌活性。裂解同等量的菌株，裂解酶的滅菌效率是抗生素的12～24倍，而且可以消除生物膜(biomembrane)，具有低耐藥性等優(yōu)點[12]。使用微克或毫克的裂解酶就可以使靶細菌在幾分鐘內(nèi)呈對數(shù)下降[13]。單獨使用裂解酶裂解細菌，裂解酶的裂菌活性隨著裂解酶濃度的增加而增強，最高的裂菌率可達99%[14]。

2.3 裂解酶有較高穩(wěn)定性

噬菌體裂解酶有較強的穩(wěn)定性，耐受的溫度范圍較寬，在短時間內(nèi)不斷改變裂解酶所處環(huán)境溫度的情況下，裂解酶仍能保持完整的活性，裂解酶Ply5218在-80 ℃條件下，活性維持時間大于7個月，4 ℃下穩(wěn)定時間超過30 d。50 ℃下維持活性時間超過30 min，70 ℃條件下孵育5 min后，其活性仍超過70%酶類[15]。同時，裂解酶適宜的pH范圍也較寬，裂解酶P28分別在pH 4.0～pH 12.0條件下，30 ℃孵育1 h，裂解酶的裂菌活性不變[14]。

2.4 裂解酶具有潛在廣泛的殺菌性能

目前關(guān)于多種裂解酶的研究都證明了裂解酶裂菌譜較窄，但是可以用物理(如高靜壓)和化學(如EDTA，弱有機酸，檸檬酸)方法處理裂解酶，增強其穿透細胞膜的能力，以拓寬其裂菌譜。也有研究發(fā)現(xiàn)一些新型的裂解酶具有廣譜的殺菌能力，單獨使用的情況下，不僅可以裂解革蘭陽性菌也可以裂解革蘭陰性菌，可用于治療混合感染[14]。

2.5 裂解酶具有安全性

裂解酶若作為一種抗菌藥物，其安全性也是不可或缺的，裂解酶的安全性檢測主要通過動物實驗體現(xiàn)的。在單劑量毒性實驗中，實驗動物未出現(xiàn)任何不良反應(yīng)，重要器官及組織也未見嚴重的炎性反應(yīng)及其他病變。在重復劑量毒性試驗中，實驗動物的體質(zhì)量，食物消化、眼科、心電圖、尿常規(guī)、血液學、血液生化和臟器重量，或宏觀和微觀檢查均未見異常變化。只有一些動物在每天均注射裂解酶，持續(xù)1周以后，才出現(xiàn)了一些短暫輕微的臨床癥狀[16]。

3 用于對革蘭陽性菌臨床感染的治療

3.1 治療葡萄球菌屬的感染

葡萄球菌是臨床常見的致病菌，主要是金黃色葡萄球菌引起的化膿性感染，近年耐藥性也有所上升，尤其是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin resistantStaphylococcusaureus,MRSA)的出現(xiàn)，使得很多抗生素治療無效，但是裂解酶對于治療各種葡萄球菌的感染的效果卻很可觀，部分裂解酶本身具有較強的裂菌活性，單獨使用就可裂解多種葡萄球菌，對于裂菌效果不滿意的，可以將作用位點不同的裂解酶混合使用，或與抗生素聯(lián)合使用，也可將裂解酶的CHAP結(jié)構(gòu)域和溶葡萄球菌素的細胞壁結(jié)合結(jié)構(gòu)域構(gòu)成嵌合裂解酶，這些措施對實驗中所有被測試的金黃色葡萄球菌菌株(包括MRSA分離株)都具有較高的抗菌活性，明顯提高了實驗中患葡萄球菌性菌血癥小鼠的存活率[17]。

3.2 治療鏈球菌屬的感染

對于裂解酶治療鏈球菌屬的感染，主要是通過構(gòu)建嵌合酶的方式，構(gòu)建方式有3種，分別為將裂解酶基因組插入前噬菌體區(qū)域內(nèi)表達出一個新型的噬菌體裂解酶，此種方式構(gòu)建的嵌合酶可拓寬裂解酶裂菌能力[18]。也可以由2種鏈球菌裂解酶構(gòu)建而來，此種嵌合酶的裂菌能力是裂解酶單體的2倍，而且還能有效抑制鏈球菌生物膜的形成?；蛘邔⒘呀饷概c肺炎鏈球菌自溶酶的細胞結(jié)合區(qū)域構(gòu)建一個嵌合酶，此種方式構(gòu)建的嵌合酶可以殺滅多株多重耐藥肺炎鏈球菌及其相關(guān)菌株，并且具有極大地高效性[19]。

3.3 其他革蘭陽性菌

產(chǎn)氣莢膜梭菌是革蘭陽性菌，在人類食源性疾病中具有重要的作用。病原菌的胞子(spore)在土壤、糞便或環(huán)境中可持續(xù)存在，并且會引起許多嚴重的動物和人類的感染，如食物中毒、氣性壞疽和壞死性腸炎。將產(chǎn)氣莢膜梭菌噬菌體裂解酶基因進行克隆，并在大腸桿菌中表達，得到的重組裂解酶進行裂菌實驗，發(fā)現(xiàn)其能特異性裂解產(chǎn)氣莢膜梭菌[11]。炭疽桿菌能夠引起人畜共患傳染病炭疽，炭疽芽胞很容易儲存，運輸和傳播，并可能在土壤中存活了幾十年。噬菌體裂解酶plyb、PlyG可作用于炭疽桿菌膜，使接種(腹腔)炭疽桿菌的100%小鼠存活，Plyb、PlyG表現(xiàn)出不同的催化活性和切割不同的肽聚糖位點，因此將兩種裂解酶聯(lián)合使用抗炭疽效果非常顯著[20]。

4 用于對革蘭陰性菌臨床感染的治療

4.1 鮑曼不動桿菌

鮑曼不動桿菌已成為最重要的醫(yī)院感染病原菌之一，因為它抵抗幾乎所有抗生素?？上驳氖?，現(xiàn)有重組裂解酶PlyAB1，30 min可殺滅206株多重耐藥鮑曼不動桿菌(multidrug-resistantA.baumannii，MDRAB)及48株泛耐藥鮑曼不動桿菌(pandrug-resistantA.baumannii，PDRAB)[10]。從基于13株鮑曼不動桿菌前噬菌體的基因組文庫中篩選出編碼溶菌活性基因，以這種方法獲得可以裂解鮑曼不動桿菌的裂解酶PlyF307，在小鼠感染模型中，1.0 mg PlyF307可使50%腹腔注射了108CFU鮑曼不動桿菌的小鼠存活[21]，有效的治療了鮑曼不動桿菌的感染。

4.2 銅綠假單胞菌

銅綠假單胞菌引起的感染多發(fā)生在衰弱或免疫受損的住院患者，常引起術(shù)后感染、肺部感染和尿路感染等，是重要的醫(yī)院內(nèi)病原菌。目前已有多項研究發(fā)現(xiàn)裂解酶在EDTA或有機酸的存在下能夠殺滅銅綠假單胞菌。也可以將抗菌肽和裂解酶共價結(jié)合構(gòu)建重組裂解酶，由于抗菌肽有靶向肽聚糖的作用，因此能夠介導裂解酶穿過革蘭陰性菌的細胞膜，5 min可使銅綠假單胞菌下降3個數(shù)量級，其中還包括一些多重耐藥的菌株[22]。

4.3 其他革蘭陰性菌

很多裂解酶因其具有特異性，所以只能針對1種細菌，但最近有研究發(fā)現(xiàn)，將裂解酶與EDTA或有機酸等細胞通透劑聯(lián)用可使裂解酶殺滅2種及2種以上的細菌。如，裂解酶ABgp46在不加細胞通透劑條件下有特異抗鮑曼不動桿菌的特性，但若與有機酸聯(lián)合使用，則其對銅綠假單胞菌和鼠傷寒沙門菌都有較強的裂解活性[23]。裂解酶Lys68僅可殺滅銅綠假單胞菌，但是若與檸檬酸或蘋果酸聯(lián)合使用，則可以在2 h內(nèi)使9～11種革蘭陰性菌下降3～5個數(shù)量級，其中包括鼠傷寒沙門菌、鮑曼不動桿菌、宋內(nèi)志賀菌、大腸桿菌、阪崎腸桿菌等[24]。

5 小結(jié)

目前由于抗生素的濫用導致各種抗藥菌株出現(xiàn)，給臨床治療帶來了極大的挑戰(zhàn)，當前迫切需要尋找新的治療方法，裂解酶的特異性、安全性和高效性使其在控制耐藥方面具有巨大的發(fā)展?jié)摿Αｋm然裂解酶仍存在某些不足但可以通過裂解酶的基因工程，設(shè)計、改造和修飾裂解酶，也可以通過與抗生素、檸檬酸和EDTA等聯(lián)合作用。這些方法不僅提高了其裂解活性和靶向特異性，更重要的是拓寬了其裂菌譜，成為了能夠解決耐藥問題的有效方法。此外，裂解酶的活性受多種因素的影響，如酶濃度、金屬離子和鹽濃度等[24]，對不同的酶，這些因素所產(chǎn)生的效果不盡相同，所以在裂解酶制劑方面，可以針對不同的酶添加不同的輔助因子以提高裂解酶制劑的治療效果。目前裂解酶不易產(chǎn)生耐藥性的機制尚不清楚，仍需進一步研究，如何利用裂解酶進行臨床耐藥菌感染的治療仍是該領(lǐng)域重要的研究方向。

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