骨髓間充質(zhì)干細胞在骨髓增生異常綜合征中的研究進展

龐艷彬，范麗霞，羅建民，杜 欣

(1.河北大學(xué)附屬醫(yī)院 血液內(nèi)科， 河北 保定 071000； 2.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院 血液內(nèi)科， 河北 石家莊 050000；3.廣東省人民醫(yī)院/廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院 華南理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院 血液內(nèi)科， 廣東 廣州 510080)

骨髓增生異常綜合征(myelodysplastic syndrome,MDS)是一組異質(zhì)性腫瘤性疾病，以骨髓無效造血并伴有向急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML)轉(zhuǎn)化的風(fēng)險為特點[1- 2]。盡管近些年對MDS造血細胞中的遺傳學(xué)和分子學(xué)認識取得長足進展，針對造血細胞的新藥如阿扎胞苷和地西他濱能夠延緩MDS向AML的轉(zhuǎn)化、延長患者總生存期[3]，然而即使產(chǎn)生治療反應(yīng)的患者大部分終將在2年內(nèi)因疾病進展而死亡[4]，說明還有其他因素參與了疾病的進展。

骨髓間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是骨髓微環(huán)境的關(guān)鍵成分[5]。MSCs具有自我更新和多向分化潛能，能夠分化為成骨細胞、脂肪細胞和軟骨細胞等多種細胞，精細調(diào)控造血干細胞(hematopoietic stem cell,HSC)以使其保持終生造血的能力[6]。此外，MSCs還具有免疫調(diào)節(jié)功能，在維持骨髓微環(huán)境的免疫穩(wěn)定方面也具有重要的作用[7]。雖然動物實驗表明MSCs中的基因異常足以誘導(dǎo)骨髓出現(xiàn)MDS表現(xiàn)[8]，并且功能異常的MSCs有助于MDS疾病的進展和AML轉(zhuǎn)化[1,7,9- 10]。但是，關(guān)于MDS來源的MSCs(MDS-MSCs)的遺傳學(xué)、表觀遺傳學(xué)、分化潛能及其在MDS進展中的作用仍然知之甚少，部分結(jié)果甚至存在矛盾[11]。因此，有必要對MDS患者MSCs的功能特點及其在疾病進展中的作用做一總結(jié)，加深對MDS發(fā)病機制關(guān)鍵步驟的理解有助于產(chǎn)生新的治療方法。

1 骨髓微環(huán)境對正常造血調(diào)控具有決定性作用

造血是HSC根據(jù)機體不同狀態(tài)的需求有序產(chǎn)生所有成熟血細胞的過程[6]。HSC需保持自我更新的能力，以終生維持造血的穩(wěn)定。但HSC具有自我更新能力并不能充分保證終生維持正常造血，因為損傷事件在HSC中累積最終可能導(dǎo)致骨髓造血衰竭或白血病樣的造血[12]，因此，HSC需要一個保護性的局部微環(huán)境，即造血干細胞龕(niche)。出生后造血干細胞龕主要存在于骨髓腔中[5]。使HSC保持相對靜止的狀態(tài)，這有利于降低外界對HSC造成的損傷，從而保持長期穩(wěn)定造血[12]。

造血干細胞龕由交感神經(jīng)細胞、間質(zhì)細胞、血細胞和免疫細胞等多種細胞構(gòu)成[6- 7]。細胞間通過細胞表面基質(zhì)、細胞因子等多種成分相互協(xié)調(diào)與參與調(diào)控細胞增殖、分化有關(guān)的細胞內(nèi)信號通路共同對HSC的調(diào)控，其中，細胞外信號在對HSC的調(diào)控過程發(fā)揮了決定性的作用[7,12]。

2 MSCs是造血微環(huán)境的關(guān)鍵成分之一

早期的動物實驗表明成骨細胞功能變化與HSC數(shù)量密切相關(guān)[13]。通過對成骨細胞進行基因加工使其活化后分泌Jagged- 1的能力明顯增加。Jagged- 1與HSC上相應(yīng)受體結(jié)合后引起HSC內(nèi)Notch信號通路活化，導(dǎo)致HSC數(shù)量增加，而抑制HSC中Notch信號通路活化則使HSC數(shù)量減少。該結(jié)果表明成骨細胞似乎是HSC龕重要成分。

然而早期的實驗結(jié)果是建立在對成骨細胞進行基因加工的基礎(chǔ)之上。但是造血調(diào)控需要造血干細胞龕內(nèi)的多種細胞之間相互協(xié)調(diào)共同完成，通過基因調(diào)控干預(yù)成骨細胞的功能，同時也可能對微環(huán)境中其他細胞的功能產(chǎn)生了影響[5]。此外，近期的研究結(jié)果充分說明基因調(diào)控后的成骨細胞對HSC的數(shù)量的影響只反映成骨細胞對HSC的間接作用，并非直接作用[14- 15]。移植后更多歸巢的HSC位于血管周圍，說明血管周圍含有參與調(diào)控HSC行為的成分[12]。

間充質(zhì)干細胞(MSCs)在整個骨髓中主要分布于血管周圍[7]，MSCs具有自我更新和多向分化潛能，可分化為成骨細胞、脂肪細胞和軟骨細胞等多種間質(zhì)細胞[11,16]。MSCs及其衍生細胞含有參與調(diào)控造血的基因，在HSC的增殖、分化、歸巢過程中發(fā)揮了重要的作用[5- 7]。此外，血管周圍的MSCs和交感神經(jīng)形成了縫隙連接復(fù)合體，在交感神經(jīng)的支配下，MSCs有節(jié)律的、脈沖性釋放CXCL- 12調(diào)節(jié)HSC動員的晝夜節(jié)律。刪除血管周圍MSCs直接導(dǎo)致骨髓中HSC的丟失[7]，因此MSCs是造血干細胞龕的重要成分。

3 MDS的腫瘤細胞受骨髓微環(huán)境調(diào)控

MDS是克隆性腫瘤性疾病的概念已被廣泛接受，MDS中的腫瘤細胞是獲得了遺傳學(xué)和/或表觀遺傳學(xué)事件后發(fā)生了轉(zhuǎn)化的正常HSC[1,3]。MDS中的腫瘤細胞是異質(zhì)性細胞，不僅不同個體間細胞中的遺傳學(xué)存在差異，即使是同一患者的腫瘤細胞在啟動疾病形成的能力方面也不同[3,9,17]。

在原位異種移植試驗中，將MDS患者的腫瘤細胞移植給免疫缺陷的NSGS小鼠[9]：移植后的小鼠具有與MDS患者相似的臨床特點；移植的 MDS腫瘤細胞啟動MDS形成和傳播的能力存在差異：只有Lin-CD34+CD38-表型的細胞才能啟動疾病的形成，且該細胞具有多向分化潛能和克隆形成能力，在連續(xù)的移植實驗中保持重建造血能力。因此，MDS的腫瘤細胞具有正常HSC的自我更新和多向分化的特性。同樣受到骨髓微環(huán)境的調(diào)控[1]。

4 MDS來源的MSCs與正常的MSCs之間存在明顯差異

動物實驗中MSCs本身基因改變可導(dǎo)致MDS的發(fā)生[8]，說明MSCs異常在MDS形成中可能具有重要作用。MDS來源的MSCs(MDS-MSCs)在體外培養(yǎng)后進行染色體核型分析，高達55.5%的MDS-MSCs存在染色體結(jié)構(gòu)異常[7]，以染色體的獲得或缺失多見，平衡易位少見。MDS-MSCs中的染色體異常與造血細胞中的情況并不相同[18- 19]，但與患者的臨床特點密切相關(guān)：MSCs中存在核型異常的患者造血細胞中多存在復(fù)雜核型；MSCs中存在異常核型的患者總生存期和無病生存期較短[19]。但是也有研究認為MDS-MSCs本身并不存在染色體結(jié)構(gòu)異常[20]，其存在的染色體異常為體外培養(yǎng)過程中非特異性損傷造成。不同實驗產(chǎn)生差異可能與多種因素有關(guān)：目前尚無統(tǒng)一的檢測標(biāo)準(zhǔn)對MSCs中染色體進行分析；MSCs的體外分離、純化、培養(yǎng)體系、待測樣本的傳代次數(shù)等都可能對結(jié)果產(chǎn)生影響[7]。但是，MDS-MSCs易于出現(xiàn)染色體結(jié)構(gòu)異常的結(jié)果至少說明MDS-MSCs中染色體結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定[7]。

MDS-MSCs 的染色體結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定說明細胞存在衰老的現(xiàn)象，該現(xiàn)象可與染色體的異常甲基化有關(guān)[6]。使用450 Infinium甲基化數(shù)據(jù)高通量分析(infinium methylation 450 K arrays)MDS-MSCs的甲基化狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)參與成骨分化的的基因中存在高度甲基化現(xiàn)象，導(dǎo)致調(diào)控早期成骨分化的轉(zhuǎn)錄因子Osterix表達明顯下降[11]。成骨分化的早期轉(zhuǎn)錄因子表達下降的MSCs移植到小鼠腎被膜下將不能形成適合HSC生長的骨髓腔樣結(jié)構(gòu)[21]。此外，參與成骨分化的基因表達下降以及體外誘導(dǎo)分化的MDS-MSCs化學(xué)染色表明其成骨分化潛能明顯下降[11,18]。說明MDS-MSCs的異常甲基化導(dǎo)致相關(guān)基因表達下降和成骨分化潛能下降。

MDS-MSCs中遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)異常以及調(diào)控成骨分化的轉(zhuǎn)錄因子表達下降，說明MDS-MSCs存在功能衰竭的現(xiàn)象。這也得到動物實驗結(jié)果的支持：在MDS的小鼠中，雖然骨髓微環(huán)境中的MSCs和成骨細胞數(shù)量增加，但功能性的MSCs并沒有增加，作為MSCs子細胞的成骨細胞合成和分泌具有骨骼形成和造血調(diào)控作用的osteocalcin無明顯升高，說明MDS骨髓微環(huán)境中的MSCs和成骨細胞功能衰竭。

MDS來源的MSCs的功能衰竭還表現(xiàn)在多種分子表達異常，如Jagged- 1、CXCL- 12(SDF- 1)、IL- 6、TGF-β、SCF、VEGF和IDO等[6- 7,11]。其中CXCL- 12是已知的唯一可直接調(diào)控HSC遷移的趨化因子，不僅調(diào)控HSC的歸巢，而且能夠使HSC龕中的HSC保持休眠狀態(tài)，降低其對化療的敏感性。雖然體外培養(yǎng)的MDS-MSCs中CXCL- 12的基因表達下降[22]，但是骨髓活檢免疫組化結(jié)果顯示MDS-MSCs中CXCL- 12的密度明顯升高[23]，造成這種差異的原因可能是實驗方法的不同，體外培養(yǎng)不能真實反映體內(nèi)的病理生理情況[7]。此外，體外培養(yǎng)的MDS-MSCs中Jagged- 1的基因表達水平與MDS骨髓活檢中免疫組化結(jié)果均表明MDS中Jagged- 1表達明顯升高。MDS-MSCs中其他相關(guān)分子表達特點及其在MDS發(fā)病機制中的作用可參考其他文獻[7,18]。

5 MDS來源的MSCs參與了MDS的疾病進展

盡管對MDS中造血細胞的遺傳學(xué)和分子學(xué)進行大量的研究，尤其近10年來，隨著第二代測序技術(shù)的廣泛應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)超過40個基因突變不僅和患者的預(yù)后相關(guān)，而且其本身也是治療的靶點。但是對MDS而言，這些突變的基因并不特異，不僅存在于AML患者，而且也存在正常人和意義未明的血細胞減少癥患者，而后者中只有部分人群最終發(fā)生MDS，說明造血細胞本身的異常并不能完全闡明MDS的發(fā)生和發(fā)展[3]。

在小鼠骨髓MSCs中敲除加工miRNA的核酸內(nèi)切酶基因Dicer1誘導(dǎo)造血細胞出現(xiàn)MDS樣表現(xiàn)[8]，說明MSCs中的基因改變在MDS的形成過程中具有重要的作用。將NHD13融合基因轉(zhuǎn)移到小鼠的造血細胞中形成MDS模型[2]，骨髓微環(huán)境中的MSCs及其分化的成骨細胞存在功能衰竭現(xiàn)象，將野生型造血細胞移植到MDS小鼠的骨髓后生成的髓系細胞比例明顯增高，表明MDS來源的MSCs支持正常HSC的功能下降；將MDS小鼠的造血細胞移植到野生型小鼠中，MDS細胞向AML轉(zhuǎn)化的速度和小鼠死亡率明顯低于MDS的小鼠，說明MDS中MSCs功能異常參與了疾病的進展和轉(zhuǎn)化。此外，MDS來源的MSCs與正常HSC的共培養(yǎng)體外實驗表明：處于G0期的正常HSC的比例明顯高于與正常MSCs共培養(yǎng)的結(jié)果(P<0.05)[11],說明MDS來源的MSCs抑制正常HSC的生長。

上述結(jié)果強烈表明MSCs的功能異?？赡苁荕DS發(fā)生和發(fā)展的重要因素，但是由于動物和體外實驗本身的局限性，直接將這些實驗結(jié)果解釋臨床問題時需謹慎。隨著實驗技術(shù)的進步，目前原位異種移植試驗?zāi)軌蜉^為真實的再現(xiàn)MDS患者臨床特點[7,9]。直接在分泌人細胞因子NSGS小鼠骨髓中注射MDS造血細胞或與體外培養(yǎng)的MDS-MSCs共同注射，結(jié)果表明[9]：MDS-MSCs增強MDS患者的腫瘤細胞移植效率，70%的移植獲得成功，而MDS造血細胞的單獨移植7例實驗中只有1例獲得成功，二者之間存在顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，說明MDS-MSCs促進MDS的HSC的增殖。臨床檢測也表明MDS-MSCs表現(xiàn)特點與患者的預(yù)后密切相關(guān)[19]：MSCs中存在異常染色體核型的MDS患者，其造血細胞易于合并復(fù)雜染色體核型，并且總生存期較正核型MSCs的患者短。骨髓活檢免疫組化結(jié)果表明[23]：高危MDS患者的骨髓活檢中MSCs的密度明顯高于低危MDS和良性血細胞減少的患者，MDS-MSCs密度增高具有重要臨床意義；在低?；蛑形籑DS患者中MSCs密度增加的患者總生存期明顯下降(57個月比18個月，P<0.05)，死亡的風(fēng)險為為低/中等MSCs密度患者的3.4倍、進展為急性髓系白血病的風(fēng)險是低/中等MSCs密度患者的2倍，說明MSCs的密度增加具有獨立的預(yù)后意義。這可能是MDS-MSCs中CXCL- 12+密度明顯高于良性病患者，MSCs可能通過與腫瘤細胞的直接作用降低腫瘤細胞對化療的敏感性，為腫瘤細胞提供了保護性微環(huán)境[24]。

綜上所述，動物實驗、體外實驗及MDS患者骨髓活檢結(jié)果均說明MDS-MSCs存在的結(jié)構(gòu)及功能異常在疾病進展過程中發(fā)揮了重要的作用，是MDS治療的潛在靶點。目前既針對MDS中克隆性造血細胞又能對MDS-MSCs的異常功能產(chǎn)生影響的藥物如去甲基化藥物和來那度胺等已在部分MDS的治療中取得顯著治療效果階段[7]。此外，我們在試驗中也發(fā)現(xiàn)小劑量的去甲基化藥物地西他濱能夠部分改善MDS-MSCs衰老相關(guān)基因的表達，并對MDS-MSCs的免疫調(diào)節(jié)功能產(chǎn)生了影響。

6 結(jié)論

目前越來越多的實驗及臨床結(jié)果表明MDS的腫瘤細胞和MSCs之間存在復(fù)雜的相互作用，通過這種作用MDS的腫瘤細胞重塑了MSCs的功能，使其有利于腫瘤細胞的增殖，降低腫瘤細胞對化療的敏感性，同時不利于正常HSC的增殖，導(dǎo)致疾病進展。因此，了解MDS來源的MSCs及疾病進展中的作用,有助于加深對MDS發(fā)病機制復(fù)雜性的認識，針對MDS腫瘤細胞與MSCs之間的相互作用的靶向干預(yù)措施，有可能成為未來MDS的一種新的治療方向。

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