小鼠頜下腺上皮細胞的體外培養(yǎng)及鑒定

張曉娟，段夢園，李 娟，郭 磊，鞠 瑞，朱 蕾，葉菜英

(中國醫(yī)學科學院 基礎醫(yī)學研究所 北京協(xié)和醫(yī)學院 基礎學院 藥理系， 北京 100005)

唾液腺是人體重要的腺體之一，包括腮腺、頜下腺和舌下腺3對大唾液腺以及散在分布口腔各壁的眾多小唾液腺，其主要功能是分泌唾液，參與咀嚼、吞咽、消化、發(fā)音和言語等[1]。唾液腺功能減退可導致相關疾病，典型代表是干燥綜合征(Sj?gren’s syndrome, SS)，該病由于唾液腺受累導致口腔干燥[2]。鑒于唾液腺是SS中的重要受損靶器官，建立唾液腺細胞體外培養(yǎng)方法對于研究其功能，進一步探討SS的發(fā)病機制以及評價SS的治療藥物具有重要意義。

本研究采用膠原酶消化法培養(yǎng)小鼠頜下腺上皮細胞，探究頜下腺上皮細胞分離、培養(yǎng)的最佳方法和條件，為進一步的實驗研究提供技術基礎。

1 材料與方法

1.1 動物與材料

SPF級C57BL/6小鼠，4周齡左右，體質量17～22 g，雌雄不拘[北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號：SCXK(京)2014- 0004]；IV型膠原酶(Sigma公司)；DMEM高糖培養(yǎng)基、F- 12培養(yǎng)基(中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所細胞資源中心)；胎牛血清(Gibco公司)；表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)(R&D公司)；細胞角蛋白8(cytokeratin 8, CK- 8)抗體、波形蛋白(vimentin)抗體和山羊抗兔IgG/Alexa Fluor 488標記(Abcam公司)；錐蟲藍染液(碧云天生物技術有限公司)；CCK- 8試劑盒(日本東仁化學科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 頜下腺上皮細胞的分離與培養(yǎng)[3- 6]：斷頸處死小鼠，75%乙醇浸泡消毒后，超凈臺內無菌摘取雙側頜下腺，冰PBS漂洗，去除附帶的脂肪、包膜等，剪碎，加入Ⅳ型膠原酶(0.25 g/L，PBS配置)，37 ℃消化3 h，期間每隔30 min輕輕振蕩以促進消化。消化后的液體經(jīng)100目篩網(wǎng)過濾后，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加紅細胞裂解液5 mL，輕輕吹打充分裂解紅細胞后，PBS清洗，用少量培養(yǎng)基(F- 12∶DMEM=3∶1，2.5% FBS，10 μg/L EGF，2 mmol/L L-谷氨酰胺，100 U/mL青霉素，100 mg/L鏈霉素)重懸細胞，調整濃度后接種于大培養(yǎng)皿中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)。每隔2～3 d換1次培養(yǎng)基，細胞鋪滿單層后進行傳代培養(yǎng)。

1.2.2 細胞形態(tài)學的觀察：從培養(yǎng)的第1天開始，每隔1 d光學顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，記錄細胞增殖狀態(tài)并拍照。

1.2.3 頜下腺細胞的純化[7]：最初分離的細胞中混有成纖維細胞，根據(jù)成纖維細胞與目的細胞貼壁能力和時間的差別，采用差速貼壁法去除成纖維細胞。成纖維細胞的貼壁能力強，在接種30～60 min左右基本完全貼壁，目的細胞約24 h貼壁。接種細胞約1 h后，將含有目的細胞的上清收集繼續(xù)培養(yǎng)，反復多次即得到純度較高的目的細胞。

1.2.4 細胞存活率的測定：接種前采用錐蟲藍染色法測定細胞存活率。取適量細胞懸液與錐蟲藍染液混勻，滴入細胞計數(shù)板。3 min內，在顯微鏡下計數(shù)300個細胞。未著色的為活細胞，呈藍色的為死細胞。計算公式：存活率(%)=(活細胞數(shù)/300)×100%。

1.2.5 免疫熒光染色鑒定細胞：取對數(shù)期細胞，爬片后4%多聚甲醛固定20 min，0.3% Triton X- 100通透，牛血清白蛋白封閉后，一抗(CK- 8 抗體或vimentin抗體)4 ℃孵育過夜。PBS清洗后，山羊抗兔IgG/ Alexa Fluor 488標記的二抗37 ℃孵育1 h，避光操作，最后DAPI染核，封片，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.6 細胞增殖曲線檢測[7- 8]：細胞消化計數(shù)后，調整細胞濃度至5×106個/L，接種至10塊96孔板，每孔200 μL細胞懸液，接種24 h后每天用CCK- 8法檢測，具體為：每孔加入20 μL CCK- 8試劑，孵育4 h后450 nm處測定吸光度值。以時間為橫軸，吸光度值為縱軸，繪制細胞增殖曲線。

2 結果

2.1 細胞存活率

接種前用錐蟲藍染色法測定細胞存活率，大約為97.5%。

2.2 頜下腺細胞的形態(tài)學特征

體外培養(yǎng)的原代細胞24 h左右貼壁，此時細胞為圓形，之后細胞慢慢伸展，呈現(xiàn)多邊形。第2天細胞開始形成集落，增殖的細胞呈形態(tài)一致的立方體，第7～8天見部分細胞表現(xiàn)為鋪路石樣排列，未見導管或腺泡樣結構(圖1)。傳代細胞與原代形態(tài)基本一致，接種后7～9 d可進行傳代培養(yǎng)，一般能傳3代，至第4代細胞活性變差，死亡的細胞變多，鏡下觀察發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中漂浮大量細胞碎片，且細胞形態(tài)轉變?yōu)樾切?，表面出現(xiàn)突起，已不適合做進一步實驗研究。

圖1 原代培養(yǎng)的頜下腺細胞Fig 1 Primary culture of the submandibular gland cells (×100)

2.3 免疫熒光染色結果

體外培養(yǎng)的頜下腺細胞CK 8表達陽性，胞質呈現(xiàn)綠色熒光(圖2A)，細胞核呈藍色熒光，陽性率約為85%；vimentin表達為陰性(圖2B)，提示培養(yǎng)的細胞為頜下腺上皮細胞。

A.culture cells were positively stained by CK 8 antibody; B.culture cells were negatively stained by vimentin antibody圖2 免疫熒光染色法鑒定頜下腺細胞Fig 2 Identification of the submandibular gland cells by immunofluorescence staining (×200)

2.4 細胞增殖特點

根據(jù)吸光度值繪制細胞增殖曲線。細胞于第1～2天處于滯留期，完成貼壁并有部分增殖，第3天開始進入對數(shù)期，細胞增殖迅速，第7天達到頂峰，隨后細胞增殖趨勢緩慢下降(圖3)。

圖3 頜下腺上皮細胞的增殖曲線Fig 3 Proliferation curve of the submandibular gland

3 討論

SS是一種常見的慢性炎癥性的自身免疫性疾病，發(fā)病率逐年增高[2]。唾液腺破壞是其重要表現(xiàn)，80%患者有口腔干燥癥，唾液分泌明顯減少，嚴重者影響說話，甚至出現(xiàn)“猖獗齒”[9]。目前SS的發(fā)病機制尚未闡明，現(xiàn)有治療方法非常有限，且收效甚微。因此建立體外細胞培養(yǎng)模型，有助于為SS以及其他唾液腺相關疾病的研究和藥物評價提供體外實驗模型。

唾液腺細胞是一種終末分化細胞，培養(yǎng)相對困難，一直是眾多學者研究的難題。目前唾液腺細胞培養(yǎng)大多取材于大鼠腮腺，或者在培養(yǎng)液中添加糖皮質激素、胰島素等以促進細胞增殖[7, 10- 11]。然而，唾液的70%由頜下腺分泌，且有研究報道SS患者的頜下腺功能損害較腮腺常見，SS患者早期頜下腺唾液流量減少亦比腮腺更顯著[12]。而且，SS作為一種自身免疫性疾病，培養(yǎng)液中添加糖皮質激素等藥物不利于細胞保持原有的功能，干擾對SS發(fā)病機制的探討以及治療藥物的評價。

目前已知頜下腺上皮細胞的培養(yǎng)方法包括組織塊法和膠原酶消化法，與前者相比，膠原酶消化法能縮短獲取大量細胞的時間[11]。本研究采用作用溫和的Ⅳ型膠原酶消化細胞以減輕對細胞的損傷，錐蟲藍染色法顯示細胞存活率達97.5%。隨后采用差速貼壁法除去混雜的成纖維細胞，獲得較為純化的目的細胞。頜下腺細胞是一種需復雜營養(yǎng)的、在一般合成培養(yǎng)基中不易增殖的細胞，我們用含10 μg/L EGF的F- 12/DMEM培養(yǎng)液進行培養(yǎng)獲得成功，簡化了實驗，且頜下腺是產(chǎn)生EGF的主要器官，體外培養(yǎng)的頜下腺上皮細胞本身可合成并分泌EGF[13]，因此添加低濃度的EGF有利于細胞增殖并保持功能，且不會影響后續(xù)實驗研究。經(jīng)過上述方法得到的原代和傳代培養(yǎng)細胞，形態(tài)呈上皮樣，鏡下觀察為多邊形，鋪路石樣排列。根據(jù)增殖曲線，細胞增殖能力良好，一般能傳3代，到第4代時，增殖能力明顯降低。在細胞鑒定方面，CK- 8表達陽性，而vimentin表達陰性，符合唾液腺細胞的表型特征，證實了所培養(yǎng)的細胞為上皮來源的可靠性。

綜上所述，本研究采用膠原酶消化法獲得了增殖良好的小鼠頜下腺上皮細胞，方法簡便易行，這為進一步研究提供了良好的實驗模型。

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