結(jié)直腸癌患者循環(huán)腫瘤DNA定量KRAS基因突變的檢測(cè)

吳兆明，劉 平，余玲玲，王金丹，Nguelemo Mayopa Kevin，駱美辰，施蘇雪，鄭曉群,*

(1.溫州醫(yī)科大學(xué)； 2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院， 浙江 溫州 325000)

結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和病死率在國(guó)內(nèi)惡性腫瘤中均排第5位[1]。隨著表皮生長(zhǎng)因子受體抑制劑如西妥昔單抗等靶向藥物的出現(xiàn)，結(jié)直腸癌患者的治療有效率和總生存時(shí)間不斷提高。研究顯示，西妥昔單抗的治療效果與患者KRAS基因型密切相關(guān)，只有野生型KRAS基因的患者才能從該藥物的治療中獲益，而突變型的患者則不能[2]。中國(guó)結(jié)直腸癌患者KRAS基因突變率約占30%～60%[3- 4]，主要為G12D、G12V和G13D突變等。近年來(lái)，循環(huán)腫瘤DNA (circulating tumor DNA, ctDNA)等液體活檢材料在臨床腫瘤研究中備受重視[5- 6]。微滴式數(shù)字PCR(droplet digital PCR，ddPCR) 技術(shù)作為第3代PCR技術(shù)因其高度靈敏性而備受臨床診斷領(lǐng)域所矚目[7]。ddPCR能定量檢測(cè)含量極低核酸分子[8- 9]，它克服了血漿ctDNA因含量低而不易擴(kuò)增的難點(diǎn)。因此，本研究以KRAS基因G12D位點(diǎn)研究靶點(diǎn)，構(gòu)建ddPCR定量檢測(cè)血漿KRAS基因突變檢測(cè)方法，為結(jié)直腸癌患者的早期篩查、預(yù)后判斷、指導(dǎo)臨床用藥及腫瘤的轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)提供準(zhǔn)確和便捷的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 受試者選擇選?。?015年3月至2016年4月在溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院的結(jié)直腸癌患者為研究對(duì)象。患者經(jīng)病理組織學(xué)確診，同時(shí)符合2010 年中國(guó)衛(wèi)生部制定的《結(jié)直腸癌診療規(guī)范》中的診斷標(biāo)準(zhǔn)。本研究共52例患者，男性29例，女性23例，年齡中位數(shù)45歲(35～82歲)。選擇同期正常健康體檢人群為對(duì)照組，共80名，男性45名，女性35名，年齡中位數(shù)38歲(25～81歲)，對(duì)照人員無(wú)腫瘤病史、無(wú)高血壓、糖尿病及高脂血癥等慢性病，無(wú)嚴(yán)重器質(zhì)性心、肝、肺等病史，妊娠期及哺乳期婦女除外。參加此項(xiàng)課題的受試群體均無(wú)血緣關(guān)系，且經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，受試者簽訂知情同意書(shū)。

1.1.2 試劑：血清/血漿游離DNA提取試劑盒(金麥格生物技術(shù)有限公司)；人類組織DNA試劑盒(Qiagen公司)；Bio-RadQX100TMddPCRTM定量試劑盒(Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 采集標(biāo)本和臨床資料：收集4 mL外周血于EDTA-K2抗凝管，1 600×g10 min，16 000×g10 min低溫分離血漿，將血漿置于-80 ℃冰箱冷凍保存。同時(shí)，采取結(jié)直腸癌患者腫瘤組織標(biāo)本，置于-80 ℃冰箱冷凍保存。

1.2.2 ddPCR技術(shù)檢出限檢測(cè)：由上海奕躍生物科技有限公司人工合成124 bp的KRAS基因目的片段克隆于pUC- 57質(zhì)粒載體，將質(zhì)粒作為野生型和突變型標(biāo)準(zhǔn)品。將突變型標(biāo)準(zhǔn)品按10倍比稀釋為8.436×105copies/μL到8.436×10-1copies/μL標(biāo)準(zhǔn)品，質(zhì)粒濃度初始濃度計(jì)算公式：(6.02×1023)×10-9(ng/μL)/(DNA length×660)=copies/μL，每個(gè)濃度的樣本重復(fù)檢測(cè)3次，以此評(píng)估ddPCR的檢出限。

1.2.3 ddPCR檢測(cè)ctDNA的KRAS基因型：按DNA提取試劑盒提取游離DNA，上游引物序列：TG GTCTGTTTTGCTTGGTCAAG，下游引物序列：GCTG TCTACACTCAACTAGCAAGGAA；探針：HEX-GAGC TGGTGGCGT和FAM-GAGCTGATGGCGT；PCR反應(yīng)體系：2×ddPCR 探針?lè)磻?yīng)混合液12.5 μL，10 μmol/L引物每條各2.25 μL，10 μmol/L探針每條各0.675 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O補(bǔ)足至25 μL。野生型與突變型質(zhì)粒分別作為野生型標(biāo)準(zhǔn)品和突變型標(biāo)準(zhǔn)品，用于陽(yáng)性及陰性對(duì)照，以保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1.2.4 Sanger測(cè)序檢測(cè)腫瘤組織的KRAS基因型：采用DNA試劑盒對(duì)新鮮組織樣本進(jìn)行DNA提取，NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)測(cè)定樣本DNA含量與純度。15 μL PCR反應(yīng)體系中包含:7.5 μL 2×Taq Plus Master mix， 0.2 μL上下游引物和2 μL DNA樣本，ddH2O補(bǔ)足至15 μL；PCR反應(yīng)條件為95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 12 min。擴(kuò)增產(chǎn)物送杭州華大基因公司在ABI3730序列分析儀上進(jìn)行雙向測(cè)序，測(cè)序結(jié)果采用Chroms軟件進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0和Graph Pad PrismV5.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，人均年齡描述位(中位數(shù)，最小值-最大值)，KRAS基因突變檢出率組間比較采用卡方檢驗(yàn)，KRAS基因G12D突變濃度組間比較采用Mann-Whitney 檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 稀釋實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)ddPCR檢測(cè)限

ddPCR技術(shù)對(duì)質(zhì)粒KRAS基因的檢測(cè)限可達(dá)8.436 copies/μL，較Taqman熒光定量技術(shù)高1個(gè)數(shù)量級(jí)(表1)。

2.2 ddPCR檢測(cè)KRAS基因G12D突變率

患者組血漿KRAS基因G12D突變率達(dá)26.92%，顯著高于健康對(duì)照的8.75%(P<0.05)(圖1)。高度分化腺癌的突變率為77.78%，顯著高于中度和低度分化腺癌的突變率(P<0.05)；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移N2的突變率為46.15%，顯著高于N0和N1(P<0.05)(表2)。

2.3 ddPCR檢測(cè)KRAS基因G12D突變濃度

結(jié)直腸癌患者組14例KRAS基因G12D突變型攜帶者中血漿突變濃度中位數(shù)為81.5 copies/mL(10～2 586 copies/mL)顯著高于健康對(duì)照7名攜帶者的16 copies/mL(7.5～23 copies/mL)(P<0.000 1)?；颊呓M淋巴轉(zhuǎn)移N2患者突變濃度中位數(shù)120 copies/mL(12～2 586 copies/mL)顯著高于N1和N0患者(P<0.05)(表2)。

表1 ddPCR技術(shù)和Taqman熒光定量技術(shù)突變基因檢測(cè)限的比較

2.4 結(jié)直腸患者血漿ctDNA和腫瘤組織KRAS基因突變檢測(cè)結(jié)果的比較

52例中16例存在KRAS基因G12D突變，其中血漿樣本檢測(cè)出14例存在KRAS基因G12D突變。

blue droplets forKRASgene wild type；green droplets forKRASgene Mutant type；A03.blank group；B03.wild typeKRASgene negative control；C03.mutantKRASgene positive control；D03-H03.sample 1～5；A03.blank group；B03.wild typeKRASgene negative control；C03.mutantKRASgene positive control；D03-H03.sample 1～5

圖1 KRAS基因G12D突變的ddPCR分析結(jié)果一維散點(diǎn)圖和微滴結(jié)果圖Fig 1 One dimensional scatter plot of ddPCR analysis results and drop result diagram of KRAS gene G12D mutation

且14例血漿和組織標(biāo)本中的突變一致，以組織樣本KRAS基因Sanger測(cè)序結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)， ddPCR檢測(cè)血漿ctDNA中KRAS基因G12D突變特異性為87.50%(表3)。

表3 52例結(jié)直腸癌患者血漿ctDNA和腫瘤組織KRAS基因G12D突變結(jié)果比較

3 討論

表皮生長(zhǎng)因子受體抑制劑西妥昔單抗是治療結(jié)直腸癌的靶向藥物，它使結(jié)直腸癌的治療進(jìn)入了個(gè)體化靶向治療時(shí)代，在臨床取得了很好的治療效果。研究顯示，西妥昔單抗治療的有效性受患者下游基因KRAS狀態(tài)的影響。只有野生型KRAS基因的患者才能從西妥昔單抗的治療中獲益，而突變型的患者則不能[10- 11]。因此，本文通過(guò)建立ddPRC技術(shù)定量檢測(cè)KRAS基因G12D突變，為臨床用藥提供指導(dǎo)。在52例結(jié)直腸癌患者的血漿樣本中共檢出了14例KRAS基因G12D突變，占26.92%，本研究結(jié)果與報(bào)道[12]的檢測(cè)860例中國(guó)結(jié)直腸癌患者腫瘤組織中16.5%KRAS基因G12D突變結(jié)果以及報(bào)道[13]的21.49%相一致；進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)血漿KRAS基因G12D突變率與分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床特征相關(guān)，血漿KRAS基因G12D突變濃度與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。這可能與腫瘤的局部擴(kuò)散，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移個(gè)數(shù)增加而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞主動(dòng)釋放ctDNA增加有關(guān)。另外，該技術(shù)對(duì)質(zhì)粒KRAS基因的檢測(cè)限可達(dá)8.436 copies/μL，較Taqman熒光定量技術(shù)高1個(gè)數(shù)量級(jí)。同時(shí)，結(jié)直腸癌患者血漿KRAS基因G12D突變與腫瘤組織突變一致性達(dá)87.50%，但由于血漿ctDNA含量較少，可能存在假陰性結(jié)果，本研究發(fā)現(xiàn)2例血漿ctDNA未檢出G12D突變。正如Sanmamed、Oxnard等[14- 15]相關(guān)報(bào)道ddPCR技術(shù)可應(yīng)用于ctDNA突變檢測(cè)。因此，本項(xiàng)目研究應(yīng)用ddPCR高敏感、高特異性的技術(shù)優(yōu)勢(shì)建立的KRAS基因突變定量檢測(cè)方法，以血漿ctDNA為檢測(cè)對(duì)象，可以實(shí)時(shí)為結(jié)直腸癌患者提供體內(nèi)腫瘤特異基因改變的信息，并進(jìn)一步為其以靶向治療為基礎(chǔ)的個(gè)體化治療用藥、預(yù)后判斷等提供準(zhǔn)確和便捷的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

[1] Chen W, Zheng R, Baade PD,etal. Cancer statistics in China, 2015[J]. CA Cancer J Clin,2016,66: 115- 132.

[2] Bokemeyer C, Bondarenko I, Hartmann JT,etal. Efficacy according to biomarker status of cetuximab plus FOLFOX- 4 as first-line treatment for metastatic colorectal cancer: the OPUS study[J]. Ann Oncol,2011,22: 1535- 1546.

[3] Arrington AK, Heinrich EL, Lee W,etal. Prognostic and predictive roles of KRAS mutation in colorectal cancer[J]. Int J Mol Sci,2012,13: 12153- 12168.

[4] Bruera G, Cannita K, Tessitore A,etal. The prevalent KRAS exon 2 c.35 G>A mutation in metastatic colorectal cancer patients: A biomarker of worse prognosis and potential benefit of bevacizumab-containing intensive regimens[J]. Crit Rev Oncol Hematol,2015,93: 190- 202.

[5] Gingras I, Salgado R, Ignatiadis M. Liquid biopsy: will it be the ‘magic tool’ for monitoring response of solid tumors to anticancer therapies[J]. Curr Opin Oncol,2015,27: 560- 567.

[6] Ma M, Zhu H, Zhang C,etal. “Liquid biopsy”-ctDNA detection with great potential and challenges[J]. Ann Transl Med, 2015,3: 235- 242.

[7] Cheng F, Su L, Qian C. Circulating tumor DNA: a promising biomarker in the liquid biopsy of cancer[J]. Oncotarget, 2016, 26,7:48832- 48841.

[8] Tang H, Cai Q, Li H,etal. Comparison of droplet digital PCR to real-time PCR for quantification of hepatitis B virus DNA[J]. Biosci Biotechnol Biochem, 2016,16: 1- 6.

[9] Aigrain L, Gu Y, Quail MA. Quantitation of next generation sequencing library preparation protocol efficiencies using droplet digital PCR assays-a systematic comparison of DNA library preparation kits for Illumina sequencing[J]. BMC Genomics,2016,17: 458- 468.

[10] Siddiqui AD, Piperdi B. KRAS mutation in colon cancer: a marker of resistance to EGFR-I therapy[J]. Ann Surg Oncol,2010,17: 1168- 1176.

[11] Dubska L, Vyskocilova M, Nenutil R,etal. KRAS mutation testing in therapeutic algorithm for treatment of metastatic colorectal carcinoma[J]. Cas Lek Cesk,2011,150: 321- 326.

[12] 謝玲, 陳劼, 孫怡,等.中國(guó)結(jié)直腸癌、肺癌和胃癌患者KRAS基因突變情況分析[J]. 臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志,2016, 32: 210- 213.

[13] Ma ES, Wong CL, Law FB,etal. Detection of KRAS mutations in colorectal cancer by high-resolution melting analysis[J]. J Clin Pathol,2009, 62: 886- 891.

[14] Sanmamed MF, Fernández-Landázuri S, Rodríguez C,etal. Quantitative cell-free circulating BRAFV600E mutation analysis by use of droplet digital PCR in the follow-up of patients with melanoma being treated with BRAF inhibitors[J]. Clin Chem,2015, 61: 297- 304.

[15] Oxnard GR, Paweletz CP, Kuang Y,etal. Noninvasive detection of response and resistance in EGFR-mutant lung cancer using quantitative next-generation genotyping of cell-free plasma DNA[J]. Clin Cancer Res,2014,20: 1698- 1705.