豬內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒在異種移植中的研究進展

邱艷，陶開山，李霄，張卓超，竇科峰（.空軍軍醫(yī)大學西京醫(yī)院肝膽外科，全軍器官移植研究所，陜西 西安 7003；.中國人民解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院，肝膽胰脾外科，北京 00853）

供體短缺是器官移植面臨的最大問題，絕大多數(shù)終末期臟器功能衰竭患者因缺乏供體器官而死亡。器官共享聯(lián)合網(wǎng)絡(luò)（United Network for Organ Sharing，UNOS）數(shù)據(jù)顯示，截止2018年3月在美國有114 965個人排隊等待器官移植，在這些人當中有74 816人亟需進行移植［1］。2018年1月完成了2 853例器官移植，然而仍有600例等待移植的患者死亡［2］。

開展異種移植研究，用動物器官代替人類器官進行移植，是目前解決器官短缺的重要途徑。而豬是目前公認的異種移植研究的最佳供體，它有著易繁殖、器官大小和功能與人類似的優(yōu)點［3］。當豬的器官移植到受體身上時，豬身上所攜帶的某些病毒有可能會傳播給靈長類動物。豬身上攜帶的豬巨細胞病毒（PCMV）和豬淋巴皰疹病毒（PLHV）在很大程度上是物種特異性的，通常不會感染人類細胞［4］。但是對于典型的哺乳動物C型反轉(zhuǎn)錄病毒——豬內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒（PERV）是否會在種間傳播存在未知性。

1 PERV病毒的生理特性

PERV是一種感染性反轉(zhuǎn)錄病毒，能夠整合到宿主生殖細胞的基因組中［5］，PERV是一種永久性的C型反轉(zhuǎn)錄病毒［6］，它在豬的組織中均有表達，在腎臟中表達量最高，胰腺中表達量最低［7］。病毒在細胞或者機體內(nèi)通過反轉(zhuǎn)錄酶的作用以RNA為模板合成DNA從而感染宿主［8-9］。PERV病毒的起源有可能是鼠的反轉(zhuǎn)錄病毒［10］。PERV基因組由3部分構(gòu)成：群特異性搞原（gag）、聚合酶（pol）和膜基因（env）。在前病毒階段，這三個基因靠長末端重復序列（LTR）連接在一起，這個序列包括了啟動子、增強子和調(diào)控子。gag基因編碼結(jié)構(gòu)蛋白，包括衣殼，核衣殼和基質(zhì)；pol基因編碼反轉(zhuǎn)錄酶、核糖核酸酶、整合酶和蛋白酶；env基因編碼跨膜蛋白（TM）和表面膜蛋白（SU）［11-12］。在膜蛋白表面有一個受體結(jié)合域，這個結(jié)合域的不同決定了PERV病毒的亞型［13］。PERV病毒分為PERV-A、PERV-B、PERV-C三種亞型；PERV-C并非存在于所有豬中且是一種嗜親性病毒，只會感染豬的細胞，而PERV-A和PERV-B存在于所有豬的基因組中，是多嗜性病毒，有可能感染人的細胞［14-15］。反轉(zhuǎn)錄病毒具備重組特性，這在病毒進化過程中發(fā)揮著重要作用，并且增加了病毒的多樣性［16］。PERV-A 和 PERV-C重組形成新的PERV-A/C分型，PERV-A/C具有高滴度復制的特征，而且能夠感染人類細胞，而且重組后的病毒是整合到豬的體細胞中而不是生殖細胞中［17］，這大大增加了感染的風險。但是有專家認為雖然PERV-A/C存在風險，但是PERV-C并不是存在于所有的豬中，因此選擇不攜帶PERV-C的豬作為供體就可以避免PERV-A和PERV-C的重組［18］。針對PERV病毒的檢測，一般檢測的是：① 細胞中的原病毒滴度；② 病毒的mRNA的表達水平；③ 病毒表達的蛋白水平；④ 病毒本身的一些產(chǎn)物，我們可以用實時熒光定量、印記雜交、熒光原位雜交等方法檢測反轉(zhuǎn)錄病毒［19］。

2 PERV病毒的研究歷史

1997年英國倫敦癌癥研究所的Clive Patience和Robin Weiss在豬細胞和人細胞的共培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)PERV可以在體外感染人體細胞［20］。在此之后哈佛醫(yī)學院的Fritz Bach教授呼吁禁停異種移植，他認為PERV病毒不僅僅會感染受體，還會感染普通人群［21］。同年，因為PERV傳播的推論，美國食品和藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）無法評估這個風險而禁停了所有相關(guān)實驗，直至1998年，F(xiàn)DA要求研究人員監(jiān)測接受豬組織治療的受體體內(nèi)的PERV病毒才解除了這個禁令［22］。2000年美國斯克里普斯研究所的van der Laan等［23］在Nature上發(fā)表一篇文章，文章中的實驗結(jié)果表明豬胰島產(chǎn)生的PERV病毒能感染人細胞，并且將豬胰島移植到免疫缺陷小鼠體內(nèi)后能持續(xù)檢測到病毒的表達，這是PERV病毒跨物種感染的第一個證據(jù)。當時的研究人員對于PERV的研究不僅僅停留在動物模型上。英國劍橋的研究團隊就在1999年進行了大型臨床研究，他們研究了160例在12年前接受過各種活體豬組織治療的患者，包括體外脾灌注、體外肝灌注、豬皮膚組織移植、豬胰島細胞移植等。共收集了160例患者的樣品對樣本中PERV病毒的DNA、搞PERV病毒搞體、PERV病毒的RNA等進行了檢測分析，分析的結(jié)果表明沒有任何決定性的證據(jù)證明PERV病毒能在種間或者人與人之間傳染。在他的研究中也包括了進行免疫抑制治療的患者，因此也排除了免疫抑制增加感染風險的可能。但是在這個實驗中發(fā)現(xiàn)了23例患者在長達8.5年中存在著微嵌合體［24］。嵌合體在體內(nèi)長時間的存在增加了傳播隱患，斯克里普斯研究所在2004年發(fā)表的文章中對嵌合體進行了分析，他們將豬和人的淋巴造血組織移植至免疫缺陷的NOD/SCID轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)，分析PERV病毒是否在人體細胞內(nèi)傳播，他們的結(jié)果并未觀察到PERV的傳播，他們認為在嵌合體檢測到的PERV序列可能是由于嗜異性小鼠白血病病毒對PERV-C病毒的假型包裝引起的，而不是變成人嗜性的PERV病毒。作者認為這也解釋了之前PERV在小鼠體內(nèi)發(fā)生種間傳播的問題。PERV由于并未檢測到人嗜性PERV病毒，因此Yang認為應(yīng)用豬進行異種移植引起物種感染的風險性并不高［25］。

3 PERV的預防策略和研究進展

雖然前期的實驗數(shù)據(jù)沒有對PERV的種間傳播提供明確的理論依據(jù)，但是微嵌合體的存在會對人體造成新的潛在風險，更何況人的人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）就來源于猿類免疫缺陷病毒的種間傳播［26-27］。除此之外，人T淋巴細胞白血病病毒-1（HTLV-1）和人T淋巴細胞白血病病毒-2（HTLV-1）也是由非人類靈長類動物傳播給人［28］。這些病毒傳播的先例更是引起了人們對PEVR病毒物種間傳播的擔憂，并且之前也有研究者用熒光素酶雙報告基因檢測揭示了重組PERV末端含有核因子Y結(jié)合位點的重復序列的長度會增加，使得病毒滴度增加與轉(zhuǎn)錄速率增加，這些數(shù)據(jù)都表明PERV有感染人類細胞的可能性，甚至可能會有更高效率的復制［29］。尋找合適的預防PERV傳播的方法變得很重要。

3.1 非基因編輯手段：因為PERV存在不安全因素，有學者嘗試尋找搞反轉(zhuǎn)錄病毒的藥物抑制病毒的表達來減少感染的可能性。搞反轉(zhuǎn)錄病毒的藥物大致分為5類：① 核苷類反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑；② 核苷酸類反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑；③ 非核苷類反轉(zhuǎn)錄酶抑制；④ 整合酶抑制劑；⑤ 蛋白酶抑制劑［30］。其中反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑中疊氮胸苷、脫氧胸苷、阿德福韋和替諾福韋被證實對PERV有效，疊氮胸苷是4個抑制劑中對PERV抑制效果最好的［31-32］。現(xiàn)暫未發(fā)現(xiàn)蛋白酶抑制劑類的藥物對PERV有抑制作用，而整合酶抑制劑中雷特格韋和度魯特韋也能抑制PERV的表達［33］。研究人員試圖通過研究搞反轉(zhuǎn)錄病毒的藥物來控制供體體內(nèi)PERV的表達，同時也是為可能的種間傳播尋找治療策略。除了搞反轉(zhuǎn)錄病毒的藥物研究，羅伯特·科赫研究所艾滋病毒和反轉(zhuǎn)錄病毒研究中心對PERV的疫苗也進行了研究，但是實驗的對象暫時限于山羊、倉鼠等動物［34］。

3.2 基因編輯手段

3.2.1 鋅指核酸酶（ZFN）技術(shù)：基因編輯的手段獲得不攜帶PERV病毒的豬是一個新的研究方向。德國的Semaan等［35］用鋅指核酸酶（ZFN）技術(shù)靶向的與豬細胞中PERV基因保守的序列特異性結(jié)合，促使病毒雙鏈的斷裂，這刺激了細胞天然的DNA修復過程，即通過同源重組和非同源末端加入，從而消除豬基因中的PERV。他們觀察到在豬細胞中能表達PERV病毒的細胞核內(nèi)ZFN高表達，遺憾的是他們發(fā)現(xiàn)ZFN在細胞核中表達后轉(zhuǎn)染的細胞就會發(fā)生凋亡的現(xiàn)象。這是因為這種修復會導致基因的插入、刪除從而導致基因的失活和不穩(wěn)定性。這個基因編輯方法的失敗使得研究人員開始尋找其他的方法。

3.2.2 CRISPR/Cas9技術(shù)：2015年 Yang等［36］在Science雜志上發(fā)表文章中提到他們成功的使豬基因中的多種PERV病毒失活。他們首先確定了PERV病毒在豬腎上皮細胞系（PK15）中的拷貝數(shù)為62，然后用轉(zhuǎn)位子或者病毒將CRISPR/Cas9轉(zhuǎn)入PK15豬細胞中，使得CRISPR/Cas9整合并且剪切細胞基因中的PERV病毒基因保守區(qū)域阻止PERV病毒的拷貝，從而成功地使豬基因中多種PERV病毒前體病毒失活。他們共培養(yǎng)了人細胞和CRISPR/Cas9處理過的PK15細胞，并以未做處理的豬細胞與人細胞共培養(yǎng)作為為對照，結(jié)果證明處理過的PK15細胞能有效地將PERV對人細胞的傳染減少1 000倍以上。在當時有人認為這個實驗雖然獲得了PERV失活的PK15細胞，但是能否成功獲得存活的PERV失活豬還是個未知數(shù)，獲得PERV失活豬需要進行體細胞核移植，而原代細胞的PERV失活是否如在PK15中一樣容易，并且PERV病毒被證實在豬胎盤的發(fā)育中有著重要的作用，這些問題都是需要克服的［37-38］。2017 年，Niu 等［39］在新刊出的文章中提到他們已經(jīng)成功地將豬胚胎成纖維細胞中的PERV前病毒失活，針對最初無法獲得高存活率的PERV失活豬胚胎成纖維細胞的問題，他們在用CRISPR/Cas9處理豬胎兒成纖維細胞時加入了搞凋亡的混合制劑，從而使得PERV失活豬胎兒成纖維細胞的存活率大大提升。并用體細胞核移植（SCNT）的方法獲得了豬胚胎，將其植入代孕母豬體內(nèi)，他們成功的獲得了PERV失活豬，這是一個突破性的進展。他們同時用PK15細胞和人胚腎細胞在體外驗證了PERV病毒在種間的傳播，同時也驗證了人細胞之間的PERV傳播，驗證了獲得PERV失活豬的意義。

4 展 望

PERV的存在阻礙了異種移植應(yīng)用于臨床。從發(fā)現(xiàn)PERV和人細胞共培養(yǎng)會發(fā)生傳播現(xiàn)象開始，即便也有研究一直證明PERV病毒在人體內(nèi)是不具備傳染性的，但很多研究者都開始對PERV進行了深入的研究尋找預防策略。PERV的易突變型使搞反轉(zhuǎn)錄的藥物和疫苗的效果受到一定的限制，而鋅指核酸酶技術(shù)使得基因不穩(wěn)定導致基因編輯失敗，CRISPR/Cas9技術(shù)的出現(xiàn)獲得了PERV失活豬，給控制異種移植中PERV傳播帶來了新的可能。PERV失活豬的產(chǎn)生推動了異種移植的發(fā)展，但是這些PERV失活的豬作為供體移植到人體內(nèi)時是否會造成其他的影響還需要更多證據(jù)和更深入的研究。只有徹底消除PERV病毒的隱患才能讓公眾接受異種移植，使異種移植運用于臨床，讓異種移植為終末期器官衰竭患者提供生的希望。