供體特異性抗體檢測在肝移植中的作用

李先亮，劉向軍，姚遠(yuǎn)（首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院肝膽脾胰?？疲本?0000；北京博富瑞基因診斷技術(shù)有限公司，北京 0076）

近年來，我國肝移植發(fā)展迅猛，已逐漸成為各種終末期肝病的有效治療手段［1-2］。隨著肝移植外科手術(shù)水平的提高、肝臟冷缺血保存技術(shù)的發(fā)展、新型免疫抑制藥在臨床逐漸推廣應(yīng)用，肝移植患者手術(shù)后早期生存率有顯著的提高。但在長期的肝移植受體中，由抗體介導(dǎo)排斥反應(yīng)（antibodymediated rejection，AMR）導(dǎo)致的慢性移植肝失功及其相關(guān)并發(fā)癥仍是影響肝移植受體長期存活的主要原因。肝移植臨床配型中，人類白細(xì)胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）配型和HLA抗體檢測是其中一種可能的原因。如何通過HLA配型和HLA抗體檢測技術(shù)優(yōu)化肝臟資源選取，避免患者預(yù)存有供體HLA抗體，及早檢測出新生供體特異性抗體（donor-specific alloantibodies，DSA），避免AMR的發(fā)生，提高移植后的患者存活率，應(yīng)該是肝移植長期存活的受體研究中需要關(guān)注的問題。

1 肝移植的免疫耐受理論

在以往的研究中，肝臟因具有特惠的移植免疫特性，其排斥反應(yīng)明顯輕于其他移植器官，往往被認(rèn)作是“免疫豁免器官”，因此肝臟容易產(chǎn)生免疫耐受［3］。這種特性的產(chǎn)生主要有兩個客觀原因：① 患者進(jìn)行肝移植后，供體肝臟產(chǎn)生的大量分泌型MHC-Ⅰ可以有效誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（cytotoxic lymphocyte，CTL）凋亡，延長移植物的存活時間［4］。② 肝臟過客細(xì)胞較多，約為25% ～50%，這種供受體間大量游走會逐漸形成微嵌合體［5］，最終使移植物被受體接受，有利于移植物的長期存活［5］。因此，肝移植一般不需要特別嚴(yán)格的HLA配型和HLA抗體的檢測。但隨著免疫學(xué)的不斷發(fā)展，有了新的研究發(fā)現(xiàn)，肝臟的排斥反應(yīng)明顯輕于其他器官移植并不是全因其具有免疫特惠的特性，而是因為肝臟具有強大的再生能力，通過排斥反應(yīng)死亡的肝臟細(xì)胞迅速再生，使肝臟的功能在排斥反應(yīng)中依然保持穩(wěn)定［6］。

2 HLA抗體檢測技術(shù)

2.1 HLA抗體檢測技術(shù)的發(fā)展：隨著體液免疫理論的不斷完善和群體反應(yīng)性抗體（panel reactive antibodies，PRA）檢測技術(shù)的發(fā)展，臨床醫(yī)生逐漸認(rèn)識到在急性、超急性、加速排斥反應(yīng)中，可能也有體液免疫參與，其中HLA抗體能迅速或緩慢地召集血液中的補體，造成移植物損傷，引起臨床意義上的排斥反應(yīng)［7］?；诿嘎?lián)免疫吸附試驗 （enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）技術(shù)的PRA檢測已逐漸成為移植術(shù)前的常規(guī)檢測項目［8］，但其具有精度低、耗時長、結(jié)果容易受到操作人員水平影響等缺陷。而在此基礎(chǔ)上發(fā)展的基于Luminex 的單抗原珠（luminex single antigen beads，LSAB）技術(shù)，同樣通過高特異的雙抗體選擇，但可以在一次實驗中完成多個目標(biāo)的HLA抗體分析，從而顛覆了過去的檢測體系，建立了一個高效快速的HLA分析和HLA抗體檢測的分析平臺［9-10］。

2.2 基于Luminex技術(shù)的HLA抗體檢測：Luminex技術(shù)應(yīng)用了微球和流式細(xì)胞儀的原理，其中微球內(nèi)含有紅色和綠色兩種熒光，通過熒光的深淺不同，Luminex平臺可以區(qū)分100種不同的微球［11］。每種微球可以用來檢測一種不同HLA抗體或基因。該技術(shù)利用熒光編碼的微球共價交聯(lián)HLA單克隆抗體或HLA分子探針，與被測定的HLA抗原或DNA結(jié)合后，加入二抗作為熒光標(biāo)記，再通過激光掃描微球的熒光編碼識別編碼和測量目的熒光的平均強度（median fluorescent intensity，MFI）［12］。基于Luminex平臺的HLA抗體檢測技術(shù)，在使用相同抗體的條件下，測量結(jié)果在準(zhǔn)確度、靈敏度和精確度上均與ELISA實驗達(dá)到相同水平，但因其通量的大幅度增加，對HLA抗體的檢測個數(shù)由原來ELISA技術(shù)的20多個上升為100個，且操作時間更短［13］，是一種更適合為臨床提供服務(wù)的檢測技術(shù)體系。

2.3 HLA抗體檢測在器官移植中的作用：隨著器官移植免疫理論的不斷發(fā)展，HLA配型與HLA抗體檢測已在腎移植和心臟移植臨床中被廣泛運用。國內(nèi)外研究機構(gòu)的臨床研究表明，HLA配型與DSA存在與腎移植術(shù)后早期排斥反應(yīng)、AMR及移植物長期存活都有著密切關(guān)系。法國圣路易斯醫(yī)院的腎移植科對402例腎移植患者進(jìn)行研究，研究結(jié)果表明，術(shù)前預(yù)存DSA的患者（60.8%），8年的腎存活率遠(yuǎn)低于預(yù)存非DSA（83.6%）或PRA陰性患者（92.5%）［14］。英國哈特菲爾德醫(yī)院移植免疫科對243例心臟移植患者進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，術(shù)后產(chǎn)生新生DSA的患者十年存活率僅為62%，而沒有產(chǎn)生新生DSA患者的十年存活率卻達(dá)到89%［15］。英國劍橋醫(yī)學(xué)院對131例準(zhǔn)備進(jìn)行再次腎移植的患者進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)DSA的發(fā)生與HLA位點的錯配個數(shù)或Epitope的錯配個數(shù)存在明顯的正相關(guān)關(guān)系［16］。預(yù)存或新生DSA在器官移植中的致病作用，除了在腎移植和心臟移植有詳細(xì)的研究報道外，還在肺移植［17］和胰腺移植［18］中有所報道。

3 肝移植患者DSA與急性排斥反應(yīng)的產(chǎn)生

3.1 PRA產(chǎn)生原理：患者在移植前，曾經(jīng)歷過輸血、妊娠或其他器官移植都有可能使體內(nèi)預(yù)存PRA。研究發(fā)現(xiàn)，器官移植產(chǎn)生的HLA抗體概率較高，妊娠產(chǎn)生的HLA抗體概率次之，而輸血產(chǎn)生HLA抗體的概率較低［19］。但因為各種原因，部分患者進(jìn)行輸血的次數(shù)會較多，研究發(fā)現(xiàn)患者經(jīng)過反復(fù)有規(guī)律的的輸血，產(chǎn)生HLA抗體的頻率可高達(dá)50%［20］。

3.2 PRA與肝移植術(shù)后的急性排斥反應(yīng)：肝移植后發(fā)生急性排斥反應(yīng)的體液免疫學(xué)機制是移植肝的肝細(xì)胞表面HLA-Ⅰ類抗原與膽管上皮細(xì)胞表面的HLA-Ⅱ類抗原與患者體內(nèi)預(yù)存的HLA抗體結(jié)合，形成抗原抗體復(fù)合物，并通過激活補體經(jīng)典途徑的級聯(lián)反應(yīng)形成攻膜復(fù)合體，直接損害移植肝的肝細(xì)胞與膽管上皮細(xì)胞［21］。另外，由于供受體之間的HLA抗原產(chǎn)生差異，移植肝進(jìn)入受者體內(nèi)后，供肝的HLA抗原被受體提呈，通過輔助T細(xì)胞的作用，激活CD8+T細(xì)胞攻擊移植肝臟，另一方面，CD4+T細(xì)胞釋放的多種細(xì)胞因子也會通過巨噬細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞（natural killer cell，NK）等間接或直接的攻擊靶細(xì)胞［22］。

3.3 肝移植后急性排斥反應(yīng)的癥狀：肝移植后急性排斥反應(yīng)的癥狀包括肝功能紊亂、血小板下降、補體水平和DSA水平上升、肝活檢顯示微血管炎性損傷［23］。這些急性排斥反應(yīng)癥狀最早可發(fā)生于術(shù)后的第2天，通常在肝移植后的數(shù)周內(nèi)發(fā)生，其發(fā)生率隨時間推移而下降。肝臟因為有強大的再生能力，使其具有一定的術(shù)前DSA的吸收能力，早期因為AMR產(chǎn)生的肝細(xì)胞損傷、肝內(nèi)膽汁淤積及膽道并發(fā)癥都有可能被肝臟的再生能力掩蓋，使患者沒有出現(xiàn)相應(yīng)的病例癥狀［24-25］。這一情況給我們通過病理學(xué)研究DSA與肝移植結(jié)果帶來了困難。研究發(fā)現(xiàn)，在正常肝移植患者中急性排斥反應(yīng)發(fā)生的概率非常罕見，因此造成的移植肝功能失功只占移植肝失功的1%，但對于預(yù)存有DSA的患者，急性排斥反應(yīng)造成的移植肝功能失功卻占到移植肝失功的 10%［25］。

3.4 預(yù)存DSA抗體與肝移植術(shù)后產(chǎn)生急性排斥反應(yīng)的關(guān)系：早前已有臨床研究表明，在進(jìn)行肝移植的患者當(dāng)中，補體依賴的微量淋巴細(xì)胞毒實驗（complement dependent cytotoxity ， CDC）陽性患者的移植肝存活率遠(yuǎn)低于CDC陰性患者［26-27］。隨著基于Luminex的HLA抗體檢測技術(shù)的成熟，幾個研究單位都利用這一先進(jìn)快捷的檢測技術(shù)對患者預(yù)存DSA與肝移植急性排斥反應(yīng)之間的關(guān)系進(jìn)行研究。Taner等［28］研究發(fā)現(xiàn)，85%的肝移植患者預(yù)存的DSA將會在移植后消失，但大部分DSA沒有消失且具有較高M(jìn)FI的患者均會產(chǎn)生AMR。Kozlowski等［29］研究發(fā)現(xiàn)，79%的術(shù)前T細(xì)胞或B細(xì)胞CDC陽性患者，肝移植后CDC會變成陰性，但是CDC持續(xù)陽性的患者將會產(chǎn)生嚴(yán)重的急性AMR。這一結(jié)果說明，肝臟雖然有強大的修復(fù)能力去減少DSA帶來的損傷，直至預(yù)存DSA耗盡，但一旦預(yù)存DSA的含量強于肝臟的自我修復(fù)能力，肝臟就會受到嚴(yán)重的病理損傷。O'Leary等［30］發(fā)現(xiàn)23%的患者在肝移植后，體內(nèi)依然保持有術(shù)前預(yù)存的HLA-Ⅱ DSA，且MFI＞5 000 ，這一因素與移植肝功能失功存在明顯的單因素正相關(guān)關(guān)系。Castillo-Rama等對896例肝移植患者進(jìn)行回顧性研究，發(fā)現(xiàn)預(yù)存的HLA-I DSA與HLA-ⅡDSA或CDC陽性患者均與移植肝功能失功和死亡風(fēng)險存在明顯的正相關(guān)性。另外，Musat等［31］發(fā)現(xiàn)患者預(yù)存DSA在肝移植術(shù)后發(fā)生急性細(xì)胞排斥反應(yīng)的風(fēng)險明顯增加。

3.5 患者新生DSA與移植肝存活：雖然肝臟強大的再生功能使我們研究DSA與肝移植的結(jié)果存在困難，但最近也有不少研究單位對此作出了報道。Kaneku 等［32］研究發(fā)現(xiàn)，肝移植后1年內(nèi)新生DSA的概率為8.2%，且進(jìn)一步研究表明1年內(nèi)產(chǎn)生新生DSA的患者比沒有產(chǎn)生新生DSA受體的患者存活率低［32-33］。Goh等［34］對139例再次進(jìn)行活體肝移植的受體進(jìn)行研究分析，發(fā)現(xiàn)HLAⅠ類抗體與移植物損傷存在明顯的正相關(guān)關(guān)系。Musat等對43例肝移植后發(fā)生急性排斥反應(yīng)或慢性排斥反應(yīng)的患者進(jìn)行肝活檢，C4d染色后發(fā)現(xiàn)，患者C4d的沉積量與DSA強度存在明顯的正相關(guān)。且隨后的研究表明肝移植后產(chǎn)生DQ DSA的患者，發(fā)生慢性排斥反應(yīng)的概率高于產(chǎn)生非DQ DSA的患者，這一研究結(jié)果與其他器官移植的臨床研究結(jié)果相吻合［35］。另外，該研究表明，肝移植受體術(shù)后新生DSA的MFI值越高，慢性排斥反應(yīng)的發(fā)生風(fēng)險越高［36］。進(jìn)一步的研究對IgG亞型與肝移植慢性排斥反應(yīng)的相關(guān)性做了分析，研究發(fā)現(xiàn)患者體內(nèi)具有多種DSA IgG亞型,比單種DSA IgG亞型更容易產(chǎn)生慢性排斥反應(yīng)（50% 比 14%），且IgG3亞型與移植物存在著明顯的正相關(guān)［37］。

4 總 結(jié)

因為肝移植免疫特惠理論和臨床肝移植免疫排斥反應(yīng)輕微的原因，我們一直忽略了DSA在肝移植后的損害作用，并在臨床中一直忽視肝移植的HLA配型和DSA的監(jiān)測，缺乏相應(yīng)的肝臟移植AMR臨床診斷指標(biāo)。移植肝臟具有強大的自我再生能力，使其能承受患者預(yù)存DSA造成的早期肝損傷。近幾年的臨床研究逐漸表明，DSA與肝移植術(shù)后的急性排斥反應(yīng)、AMR發(fā)生與移植肝存活時間存在明顯的正相關(guān)，如果術(shù)前預(yù)存的HLA II類抗體較多，產(chǎn)生的肝損傷強于肝自身的恢復(fù)能力，就會產(chǎn)生強烈的急性排斥反應(yīng)，降低移植受體的存活率。相比于腎移植和心臟移植，對于如何利用DSA指導(dǎo)肝移植臨床篩選供體和用藥還在起步階段。未來還需要利用更大規(guī)模的肝移植受體進(jìn)行DSA與病理學(xué)結(jié)果的分析，并思考如何共同利用DSA MFI值、DSA IgG亞型、DSA召集補體C1q和C3d這些指標(biāo)，共同預(yù)測肝移植后急性排斥反應(yīng)和慢性排斥反應(yīng)的發(fā)生，期望達(dá)到最佳肝臟移植存活效果。