牛奶、嬰兒配方奶粉中硒元素的形態(tài)研究進(jìn)展

劉夢霞，于景華

（天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津300457）

0 引言

硒在自然界中通常以有機(jī)形式和無機(jī)形式存在[1]。各種硒化合物的不同的生理、生物活性，及其遷移轉(zhuǎn)化規(guī)律，不僅取決于硒的總質(zhì)量分?jǐn)?shù)水平，而且同硒存在的化學(xué)形態(tài)以及不同化學(xué)形態(tài)下硒化物的濃度水平直接相關(guān)[2]。有研究表明硒的有機(jī)形式吸收率可達(dá)85%～95%，而無機(jī)形式吸收率僅為40%～50%左右[3]。動物體中的硒主要與蛋白質(zhì)結(jié)合，硒在人體內(nèi)發(fā)揮生理作用主要是通過硒蛋白來實現(xiàn)的[4]。硒是目前公認(rèn)的人體必需微量元素之一[5]。它是人體多種蛋白質(zhì)的重要組分，還有提高人體免疫力，抗氧化、對抗自由基，預(yù)防癌癥等多種功效[6]。

研究牛奶和嬰兒配方奶粉中的硒元素對嬰兒健康有重要意義。本文對現(xiàn)有的牛奶、嬰兒配方奶粉中硒元素形態(tài)的研究進(jìn)行總結(jié)、比較，旨為嬰兒配方奶粉中硒元素形態(tài)研究提供指導(dǎo)。

1 牛奶蛋白中的硒

在牛奶中，大于95%的硒與蛋白質(zhì)相連。對脫脂乳進(jìn)行超速離心，分離得到酪蛋白和乳清蛋白，通過離子交換色譜和凝膠色譜分別分離酪蛋白和乳清蛋白中的蛋白質(zhì)，氫化物原子吸收光譜法測定分離所得各種蛋白質(zhì)中硒元素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，得到牛奶蛋白中的硒元素分布情況如表1所示[7]。從表中可以看出大于70%硒存在于酪蛋白中。單位質(zhì)量κ-酪蛋白含硒量最多，但由于奶中κ-酪蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)低，所以該蛋白中的硒質(zhì)量分?jǐn)?shù)僅占脫脂乳硒質(zhì)量分?jǐn)?shù)的17%，而β-酪蛋白中硒的質(zhì)量分?jǐn)?shù)占脫脂乳硒質(zhì)量分?jǐn)?shù)的33%，比例最大，αs-酪蛋白、β-乳球蛋白中硒質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別占脫脂乳硒質(zhì)量分?jǐn)?shù)17%，6%～8%，其他蛋白中硒質(zhì)量分?jǐn)?shù)占脫脂乳硒質(zhì)量分?jǐn)?shù)的3.5%。Bierla[9]等人在研究硒元素在牛奶蛋白中的存在形式時，也表明大部分硒元素存在于酪蛋白中；而硒元素與乳清蛋白結(jié)合，可能是通過硒代甲硫氨酸殘基取代β-乳球蛋白、α-乳白蛋白中的甲硫氨酸殘基，形成新的含硒蛋白質(zhì)。T IEN HOAC[8]也證實硒元素在牛奶乳清蛋白中主要與β-乳球蛋白、α-乳白蛋白結(jié)合。

表1 牛奶中硒元素的分布情況[7]

2 奶中硒元素形態(tài)的測定

硒元素在牛奶和嬰兒配方奶粉中通常以硒化合物（如硒-蛋白質(zhì)、硒-多肽）的形式存在，這類乳制品中復(fù)雜的成分會對硒化合物的提取造成干擾，降低硒化合物的提取效果，進(jìn)而影響其測定準(zhǔn)確性。因而許多學(xué)者針對提取及測定硒化合物的方法進(jìn)行改進(jìn)優(yōu)化，提高硒元素在乳制品中的測定準(zhǔn)確性。例如學(xué)者林立[10]改進(jìn)的酸處理法能夠提高硒元素的形態(tài)穩(wěn)定性。下面對這些方法的優(yōu)缺點進(jìn)行論述。

2.1 樣品處理方法

2.1.1 酸法處理

林立[10]等人在測定奶粉中硒形態(tài)時，對樣品進(jìn)行乙酸沉淀蛋白、流動相（三氟乙酸、檸檬酸、乙醇）提取，通過加標(biāo)回收試驗驗證，發(fā)現(xiàn)采用該方法提取時，硒元素的各形態(tài)之間未發(fā)生相互轉(zhuǎn)化。而且在后續(xù)ICP-M S方法測定過程中能夠減小基質(zhì)效應(yīng)的影響，增強(qiáng)檢測的靈敏度、準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。但在測定得出結(jié)果后發(fā)現(xiàn)該提取方法對奶粉中硒代胱氨酸的提取效率低，一方面由于硒代胱氨酸易與奶粉中的蛋白質(zhì)吸附共沉淀，另外硒代胱氨酸中的Se-Se化學(xué)鍵不穩(wěn)定，容易斷裂與蛋白結(jié)合，因此采用合適的離子對試劑并采用溫和的提取方式，可以有效地絡(luò)合硒代胱氨酸，避免破壞硒代胱氨酸的穩(wěn)定性，從而提高硒代胱氨酸的提取率。

2.1.2 酶解法

通過酶解的方法可以使牛奶、嬰兒配方奶粉中的含硒蛋白質(zhì)、多肽分解，從而得到含硒氨基酸，再對其進(jìn)行質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定。而且酶解的條件溫和，大多數(shù)為37℃，pH 7.0，不易引起乳制品中硒元素形態(tài)之間發(fā)生轉(zhuǎn)變。通常使用蛋白酶和脂肪酶處理，提取過程中需要控制酶解溫度、時間及光照情況，以防止有機(jī)硒轉(zhuǎn)化為無機(jī)硒，影響測定結(jié)果[11-13]。但此方法時間略長，通常在10 h以上，在后續(xù)提取過程中可改進(jìn)方法如超聲輔助酶解等以提高效率。

2.1.3 有機(jī)溶劑提取法

有學(xué)者用蛋白沉淀法即乙腈提取牛奶中的游離硒蛋氨酸，可以直接提取出純的硒蛋氨酸，避免了分離硒化合物的繁瑣步驟，同時減少了對硒蛋氨酸形態(tài)的影響，在后面使用UPLC-M S/M S方法測定硒蛋氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)時可以得到較好的精確度、精密度[14]。但該方法僅對游離硒蛋氨酸提取效率高，有其他硒元素形態(tài)相互轉(zhuǎn)化的風(fēng)險。

2.1.4 微波消解法

微波消解法能同時加熱所有的樣品溶液而不加熱容器，微波加熱時，溶液能很快達(dá)到沸點，同時微波能引起酸與樣品之間較大的熱對流，攪動并清除已消解的不活潑樣品的表層，促進(jìn)酸與樣品更有效地接觸。在加壓的條件下，酸的氧化及活性增加，使粒徑大的樣品也能在短時間內(nèi)被消化。其次，微波消解是在密閉的容器中進(jìn)行的，待測元素的損失較少，回收率較高，因微波消化過程中酸的消耗少，減少了由于酸而帶入的污染，從而提高了測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。常用的酸為硝酸[15-16]。

2.2 硒化物分離及形態(tài)測定方法

2.2.1 離子色譜－電感耦合等離子體質(zhì)譜法

有國內(nèi)學(xué)者采用離子色譜－電感耦合等離子體質(zhì)譜法（IC-ICP-MS）檢測嬰兒配方奶粉中硒的形態(tài)，通過優(yōu)化提取方法和色譜條件，能夠?qū)崿F(xiàn)硒酸鹽、亞硒酸鹽、硒代蛋氨酸和硒代胱氨酸的定性定量分析，方法的檢出限在0.03～0.10μg/L之間。加標(biāo)回收率在25.0%～105%之間，測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）在1.8%～7.8%之間。測定6種奶粉檢測出硒酸鹽、亞硒酸鹽，均未發(fā)現(xiàn)硒代蛋氨酸[10]。分析可能是奶粉中硒代蛋氨酸質(zhì)量濃度低于該檢出限，可以嘗試將蛋白溶液進(jìn)行低溫濃縮，使硒代蛋氨酸質(zhì)量濃度升高，然后重新進(jìn)行檢測。若仍未發(fā)現(xiàn)硒代蛋氨酸，則可推斷該嬰兒配方奶粉中可能不存在硒代蛋氨酸。ICP-MS具有很高的靈敏度、準(zhǔn)確度，并且它與色譜的接口容易實現(xiàn)，色譜分離柱與ICP-MS的霧化器直接相連即可。由于上述的眾多優(yōu)勢，電感耦合等離子體-質(zhì)譜已經(jīng)成為元素形態(tài)分析的重要工具。

2.2.2 液相色譜-氫化物發(fā)生原子熒光光譜法

原子熒光光譜靈敏度高，選擇性好，適用于氫化物發(fā)生元素的測定。在線性范圍以及光譜干擾等方面均比原子吸收光譜優(yōu)越。同時，原子熒光光譜儀器設(shè)備購買和運行的費用低，一般的實驗室就可以配備。

O scar[11]等人通過液相色譜-紫外-氫化物發(fā)生-原子熒光光譜法聯(lián)用技術(shù)分析喂養(yǎng)不同硒化物飼料的奶牛產(chǎn)出的牛奶中硒的形態(tài)。使用反向色譜C 18柱，流動相選用氯化四乙胺，優(yōu)化預(yù)還原條件即使用紫外照射和電熱板來提高不同硒化物轉(zhuǎn)化效率。最后測得硒代胱氨酸、Se（IV），硒代蛋氨酸、Se（VI）檢出限分別為0.4，0.5，0.9，1.0μg/L。在喂養(yǎng)含硒酵母飼料的奶牛產(chǎn)出的牛奶檢測出亞硒酸鹽、硒代胱氨酸和少量硒代蛋氨酸；在喂養(yǎng)無機(jī)硒飼料的奶牛產(chǎn)出的牛奶中僅檢測到硒代胱氨酸和亞硒酸鹽。表明奶牛攝入硒的形態(tài)對牛奶中硒元素的形態(tài)有影響。該方法可用于測定牛奶中硒的形態(tài)，快速方便且重復(fù)性高，檢出限低，可用于常規(guī)牛乳質(zhì)量檢測。

Pilar Vinas[12]等運用液相色譜-氫化物發(fā)生原子熒光光譜法的聯(lián)用技術(shù)分析嬰幼兒配方奶粉中硒的形態(tài)：亞硒酸鹽、硒酸鹽、硒代胱氨酸和硒代蛋氨酸，檢出限分別為0.4，1.7，0.35，0.54μg/L。該方法使反相C 18色譜柱和離子交換柱串聯(lián)連接，流動相為水、磷酸鹽緩沖液。用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)即已知硒元素含量和種類的全脂奶粉樣品驗證該方法可靠性，證實該方法可以用于奶粉中硒元素形態(tài)的測定。用本方法檢測6種嬰兒配方奶粉，結(jié)果顯示僅含亞硒酸鹽。

2.2.3 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

UPLC-MS/MS法具有特異性好、靈敏度高、分析速度快和準(zhǔn)確可靠的優(yōu)點，適用于牛奶中游離硒代蛋氨酸（SeMet）的定量測定。何夢潔[14]等人建立超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定硒SeMet的方法，使用C 18色譜柱，以水∶乙腈∶甲酸（95∶5∶0.1，體積比）為流動相。結(jié)果SeMet線性范圍為0.5～100 ng/mL，SeMet批內(nèi)準(zhǔn)確度在97.6%～100.6%，批間準(zhǔn)確度在97.7%～99.2%，批內(nèi)精密度在0.53%～4.49%，批間精密度在1.03%～4.54%。用于測定牛奶中游離SeMet，牛奶中游離SeMet質(zhì)量濃度為0.74 ng/mL。

2.2.4 石墨爐原子吸收法

Tuzen等[16]用超聲輔助離子液相分散液液微萃取-石墨爐原子吸收法測定飲料中硒酸鹽、亞硒酸鹽的含量，并測定出牛奶、水果、酒類等食物中硒元素的總量。黃高明[15]采用超聲波破碎，離心、透析的方法將有機(jī)硒與無機(jī)硒分開，微波消解法進(jìn)行樣品消化，利用石墨爐原子吸收法對富硒酸奶中有機(jī)硒的質(zhì)量濃度進(jìn)行測定。該方法檢出限為2.5μg/L，精密度為3.24%～8.27%（RSD），加標(biāo)回收率為98.5%～101.3%，這些方法都可以借鑒到嬰兒配方奶粉的硒元素的測定中。

3 不同分子量乳清蛋白中的分布情況

Bermejo[17]采用SEC-HPLC-HG-ETAAS聯(lián)用技術(shù)測定了硒元素在牛奶乳清中的分布情況。為克服硒元素在牛奶乳清各蛋白中濃度低的問題，優(yōu)化富集硒元素的條件，首先離心分離牛奶不同成分即脂肪、乳清、酪蛋白，收集乳清部分并進(jìn)行超濾濃縮，濃縮物進(jìn)入SEC色譜分離，UV檢測蛋白質(zhì)。超濾濃縮蛋白部分，消化并收集硒氫化物，在銥涂層石墨管中預(yù)富集硒氫化物。ETAAS Zeeman背景校正法測定硒元素的含量。實驗中測定了6種牛乳基嬰兒配方奶粉，結(jié)果表明硒元素主要存在于分子量為40 ku，大于160 ku，小于10 ku部分，其中分子量小于10 ku部分硒含量最高。與Rafael等人[18]的研究結(jié)果一致：試驗的絕大多數(shù)嬰兒配方奶粉樣品中，硒元素分布在低分子質(zhì)量蛋白部分。與前文測定牛奶中硒元素分布情況對比，可以發(fā)現(xiàn)牛奶與嬰兒配方奶粉中硒元素分布不同。說明在嬰兒配方奶粉原料調(diào)配及生產(chǎn)過程中硒元素形態(tài)含量都發(fā)生了變化，而研究這些具體的變化對嬰兒營養(yǎng)健康狀況意義重大。

4 加工過程對硒元素的影響

目前國內(nèi)外對嬰兒配方奶粉生產(chǎn)過程中硒元素形態(tài)變化研究較少。L.H.Foster等人[19]在1998年研究了巴氏殺菌和噴霧干燥對液態(tài)奶、強(qiáng)化硒酸鈉、亞硒酸鈉液態(tài)奶中硒含量的影響。通過分別配制標(biāo)準(zhǔn)液態(tài)奶、強(qiáng)化硒酸鈉、亞硒酸鈉液態(tài)奶，進(jìn)行巴氏殺菌、噴霧干燥工藝的對照處理，用氫化物原子吸收分光光度計法測定硒含量得出結(jié)論：巴氏殺菌使液態(tài)奶、強(qiáng)化硒酸鈉液態(tài)奶、強(qiáng)化亞硒酸鈉液態(tài)奶中硒含量含量分別減少了7.9%，6.2%，7.0%。噴霧干燥使液態(tài)奶、強(qiáng)化硒酸鈉液態(tài)奶、強(qiáng)化亞硒酸鈉液態(tài)奶中硒含量分別減少了44.8%，11.4%，10.0%。巴氏殺菌、噴霧干燥之后液態(tài)奶、強(qiáng)化硒酸鈉液態(tài)奶、強(qiáng)化亞硒酸鈉液態(tài)奶中硒含量含量分別減少了49.2%，17.6%，15.6%。分析硒含量減少的原因可能為加熱過程中熱空氣和粉末顆粒之間的溫差導(dǎo)致液態(tài)奶中固有的硒減少；存在于乳清中的谷胱甘肽過氧化物酶中加熱過程中被破壞導(dǎo)致硒元素在噴霧干燥過程中揮發(fā)。

莫海珍在2007年研究甘藍(lán)及毛豆儲存及加工過程中硒元素形態(tài)的變化。試驗中甘藍(lán)的含硒組分以甲基硒半胱氨酸為主，其次為硒蛋氨酸，另外含有痕量的硒胱氨酸，在毛豆中硒主要以硒蛋氨酸的形式存在，而硒甲基硒半胱氨酸的含量很少。冷藏會導(dǎo)致硒的含量隨著時間的延長而減低，采用真空烘干、熱風(fēng)烘干和噴霧干燥對于甘藍(lán)和毛豆進(jìn)行脫水，其中冷凍干燥對于有機(jī)硒的保存率最高，硒蛋氨酸是熱不穩(wěn)定成分，在噴霧干燥過程中損失最大。說明加熱、噴霧干燥等加工過程會對硒元素的形態(tài)變化產(chǎn)生影響。

總結(jié)上述研究結(jié)果，學(xué)者林立[10]、Pilar Vinas[12]僅在奶粉中發(fā)現(xiàn)硒元素的無機(jī)形態(tài)，而研究牛奶中硒元素形態(tài)時，O scar[11]、何夢潔[14]等都檢測出了硒元素的無機(jī)形態(tài)和有機(jī)形態(tài)?？梢酝萍拔匦螒B(tài)在嬰兒配方奶粉的加工過程中發(fā)生了變化，但具體發(fā)生了哪些變化和變化的機(jī)理還有待研究。

5 展望

對于不能被母乳喂養(yǎng)的嬰兒來說，嬰兒配方奶粉是嬰兒的主要營養(yǎng)來源，營養(yǎng)元素的形態(tài)關(guān)乎其吸收狀況和嬰兒的成長。目前來看，由于現(xiàn)行的主流方法都依賴于特定形態(tài)的標(biāo)準(zhǔn)硒化物，而現(xiàn)有的標(biāo)準(zhǔn)品只有僅限的幾種，并不能滿足全面分析乳制品中硒元素形態(tài)的要求，所以導(dǎo)致對牛奶、嬰兒配方奶粉中硒元素形態(tài)認(rèn)知不全面，能確定的形態(tài)僅有硒酸鹽、亞硒酸鹽、硒代蛋氨酸、硒代胱氨酸；而且在奶粉加工過程中的硒元素的含量、形態(tài)變化研究甚少。另外，由于硒元素在牛奶、奶粉中含量非常少，而且多與蛋白相連，硒化合物提取過程中極易被破壞，所以需要不斷探索出靈敏度高、精確度高的測定方法，預(yù)測多維分離手段結(jié)合及多項分析技術(shù)聯(lián)合將成為未來發(fā)展趨勢。

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