應用有害結局路徑思維把關乳制品雌激素安全

陳雪平，宋曉丹

（1.水中銀（國際）生物科技有限公司（香港）香港，999077；2.圣元營養(yǎng)食品有限公司北京營養(yǎng)研究院，北京100020）

0 引言

雌激素安全是乳制品行業(yè)近年關注的焦點之一。雖業(yè)界及政府部門普遍認為牛奶中的內(nèi)源性雌激素對于人體無害，國際研究卻指出內(nèi)源雌激素亦會干擾人體內(nèi)分泌系統(tǒng)，且影響并不亞于外源性雌激素[1]。有鑒于此，文中以ChgH-GFP轉(zhuǎn)基因鯖鳉魚自由胚胎測試雌激素為例，首創(chuàng)提出應用“有害結局路徑”思維把關乳制品雌激素安全。闡述通過測量雌激素“有害結局路徑”中的某些位點，如被誘導ChgH基因的表達，來測量乳制品中的總體雌激素水平，并建議按照聯(lián)合糧農(nóng)組織/世界衛(wèi)生組織食品添加劑聯(lián)合專家委員會設立的雌二醇每日允許攝入量[2]探討乳制品的雌激素安全閾值。

1 乳制品中的雌激素內(nèi)分泌干擾素污染問題

工業(yè)化的畜牧業(yè)基于成本效益，產(chǎn)奶的奶牛一般都處于懷孕期，導致生產(chǎn)的牛奶會有較高量的雌激素及孕酮。此外，使用雌激素、雌二醇及其衍生物于母畜身上亦有助于提高產(chǎn)奶量及延長產(chǎn)奶期，而激素的殘留時間較長，養(yǎng)殖期間使用的激素很大可能會殘留于牛奶中。除了牛奶中的天然激素及養(yǎng)殖過程中外加的合成激素，在乳制品制作過程中亦存在受雌激素內(nèi)分泌干擾物污染的風險。有實驗證明牛奶中的確含有一定份量的雌激素代謝產(chǎn)物[2]，并發(fā)現(xiàn)九成國內(nèi)外嬰幼兒配方奶粉含有會影響雌激素內(nèi)分泌系統(tǒng)平衡的孕酮[3]。牛奶被視為人類吸收雌激素的主要食物來源之一。有研究發(fā)現(xiàn)，測試者飲用牛奶后血液及尿液中的激素含量的確有所提升[1]，證明乳制品中含有足以影響飲用者雌激素內(nèi)分泌系統(tǒng)的物質(zhì)。

聯(lián)合國環(huán)境保護署和世界衛(wèi)生組織于2012年發(fā)布的關于《內(nèi)分泌干擾素現(xiàn)狀》的聯(lián)合報告中指出，雌激素會影響性器官及神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育，可能引致生育能力下降，性早熟、肥胖、內(nèi)分泌失調(diào)和精神紊亂，對于處于急速成長期的嬰幼兒童影響尤其嚴重[4]。嬰幼兒一旦受到荷爾蒙干擾，所造成的影響可能會到青春期才顯示出來。有關雌激素類物質(zhì)對猴子雄性嬰兒影響的深入研究指出，雄性猴子于幼兒期間內(nèi)分泌系統(tǒng)一旦受到干擾，除了導致延遲踏入青春期外，更會降低成年后的生育能力和骨質(zhì)密度，并對神經(jīng)系統(tǒng)造成永遠久傷害[5]。嬰幼兒奶粉為成長中嬰幼兒的主食，其雌激素安全性問題必須重視。

2 雌激素作用機制及安全把關的挑戰(zhàn)性問題

雌激素對生物體的主要功能是維護生理平衡和促進并維護女性的第二性征。雌激素對生物體的作用主要是通過與雌激素受體結合，啟動雌激素信號傳遞通路，即調(diào)控雌激素受體下游基因表達來實現(xiàn)的。內(nèi)源性雌激素的作用機制如此，外源性雌激素的作用機制也是如此，而某些本身不具雌激素功能的化合物則有可能通過干擾雌激素和雌激素受體之間的相互作用，從而起到增強或抑制雌激素活性的作用。由此可見，在討論乳制品雌激素安全時，只是關注幾種內(nèi)源或外源雌激素是不夠的。

我國農(nóng)業(yè)部早在2002年就已禁止使用己烯雌酚等合成雌激素藥物，并規(guī)定食品中不得檢出該類物質(zhì)。然而最新的《食品安全國家標準》有關乳制品的規(guī)定中并未列明關于雌激素的監(jiān)管[6-8]。乳制品中雌激素水平測試多半停留在學術研究層面，且主要為氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法，液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法高效液相色譜－四極桿串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜等化學分析方法[9-10]。這些方法雖可測出特定雌激素于樣本中的精確含量，但程序較為繁復，且不能同時測試出未知雌激素。退一步說，即使化學分析可以測試出乳制品中所有的雌激素內(nèi)分泌干擾素，目前的毒理學知識也還不足以評估多種物質(zhì)混合在一起時的總體生物學效應。

3 應用有害結局路徑評估乳制品雌激素安全

有害結局路徑這個概念是2010年正式提出的[11]，是用于描述分子起始事件（如：雌激素與雌激素受體相互作用）與在生物不同組織結構層次（如：基因、細胞、器官、機體、群體）中出現(xiàn)的與危險度評定相關的“有害結局”之間的相互聯(lián)系。有害結局路徑已經(jīng)成為了構建毒理學知識框架、以支持基于機理機制所進行的化學品安全評估的核心元素。當一種化合物與生物中的分子相互作用，經(jīng)過一系列于生物不同組織結構層次中的傳遞，最終出現(xiàn)個體或社會群體層面的有害結局。整個有害結局路徑可以用來概括某種化合物對生物造成的傷害，亦可以預測其它擁有相同生物活性的化合物對生物造成傷害的風險?？偟膩碚f，有害結局路徑這一概念框架強調(diào)的是風險評估應著眼于有關物質(zhì)對生物造成的傷害[12-14]。

將有害結局路徑這一毒理學思路應用到探討乳制品雌激素安全問題上時，關注的應該是雌激素所造成的“有害結局”，而非雌激素是屬于內(nèi)源還是外源性問題。原因在于不論是內(nèi)源或外源雌激素，在生物體內(nèi)都會啟動雌激素信號傳遞通路，通過改變基因表達最終對生物造成“有害結局”。因此，通過檢測和“有害結局”相關聯(lián)的基因表達的改變更能保障食用者健康。

4 轉(zhuǎn)基因魚自由胚胎測試雌激素技術

基于對雌激素作用機制的深入了解和研究，我們基于雌激素的“有害結局路徑”研發(fā)了應用轉(zhuǎn)基因鯖鳉魚（Oryzias melastigma）自由胚胎（eleutheroembryo）測試樣品中的總體雌激素水平（雌激素當量，即相當于多少雌二醇）的技術[15-17]。雌激素對鯖鱂魚的作用機制和對我們?nèi)梭w相似，也是通過和雌激素受體結合后啟動雌激素受體下游基因表達的改變而造成“有害結局”的。鯖鱂魚卵殼內(nèi)膜蛋白基因ChgH是雌激素依賴的雌激素受體下游基因[18]。當帶有卵殼內(nèi)膜蛋白基因啟動子連接著綠色熒光蛋白（GFP）基因編碼區(qū)的轉(zhuǎn)基因鯖鳉魚自由胚胎遇到具有雌激素活性的物質(zhì)時，其卵殼內(nèi)膜蛋白基因啟動子就會響應上游雌激素受體的調(diào)控，啟動綠色熒光蛋白基因的表達合成綠色熒光蛋白。合成的綠色熒光蛋白的多少與雌激素量呈正相關。因此，將自由胚胎暴露于待測溶液一段時間（如24 h）后，于熒光顯微鏡下觀察并測量綠色熒光蛋白的熒光強度，通過比較樣品所誘導的熒光強度和雌二醇的熒光強度-劑量反應曲線便可計算出樣品的雌激素質(zhì)量分數(shù)。在24 h暴露的標準測試程序下，該方法對雌二醇的檢測限為1μg/L。當樣品和一定量雌二醇同時暴露時，該方法還可測出樣品是否具有增強或抑制雌激素活性[19]。

5 轉(zhuǎn)基因魚自由胚胎測試的技術優(yōu)勢

轉(zhuǎn)基因鯖鳉魚自由胚胎測試雌激素當量技術是通過對雌激素“有害結局路徑”中的雌激素受體下游基因ChgH的表達進行可視化實現(xiàn)的。由于ChgH是雌激素受體下游基因，該技術所測試的是和雌激素受體結合后成功啟動了雌激素“有害結局路徑”的物質(zhì)，避免了假陽性結果的出現(xiàn)。同時該方法測試的是樣品中的所有雌激素內(nèi)分泌干擾素對于生物體造成的影響，反應了樣品經(jīng)過生物吸收，體內(nèi)轉(zhuǎn)化以及物質(zhì)間相互作用后導致的最終生物學效應。

該測試應用的鯖鱂魚是一種大小和生長周期都類似于斑馬魚（Danio rerio）的實驗室動物模型，具有個體小（成魚3～4 cm），繁殖力強(約200粒魚卵/周/對魚)，生殖周期短（從魚卵到產(chǎn)卵期約為3～4個月），早期發(fā)育透明（方便觀察）等優(yōu)勢。根據(jù)歐盟最新動物保護法[20]，魚的胚胎和自由胚胎不被界定為動物，是國際科學家大力推崇以替代動物測試的方法之一。因此該方法為動物測試替代法。

6 轉(zhuǎn)基因魚自由胚胎測試乳制品雌激素案例示范

作者嘗試將該技術應用于測試乳制品中的雌激素水平。于2012-2013年對香港市場上8大國際品牌之29個嬰幼兒奶粉(其中有些是屬于同一品牌同一階段不同批次的奶粉)樣品(表1)進行了收集和測試。樣品經(jīng)過有機溶劑提取后稀釋于水溶液中，轉(zhuǎn)基因鯖鳉魚自由胚胎暴露于稀釋液中24h后于熒光顯微鏡下測量所誘導的綠色熒光強度并分析計算出樣品的雌激素質(zhì)量分數(shù)。測試結果顯示3大品牌之8個樣品檢測出雌激素活性（表1），其中5個為6～12個月嬰兒奶粉，雌激素當量為14～64 ng/g雌二醇；2個為1～3歲幼兒奶粉，雌激素質(zhì)量分數(shù)為80 ng/g雌二醇；1個為6～12歲兒童成長配方奶粉，雌激素質(zhì)量分數(shù)為14 ng/g雌二醇。

表1 奶粉樣品信息及雌激素質(zhì)量分數(shù)測試結果

上述所測的大品牌產(chǎn)品在雌激素含量上應該都能達到法定要求，然而應用轉(zhuǎn)基因鯖鳉魚自由胚胎測試雌激素當量技術卻發(fā)現(xiàn)多個產(chǎn)品具有一定量的雌激素活性。如果參照JECFA設立的雌二醇安全攝入量（0～50 ng/kg體質(zhì)量）[2]，嬰幼兒體重以及奶粉包裝上建議的每日喂哺量，那5個6～12個月以及2個1～3歲陽性奶粉樣品在雌激素安全問題上值得關注。這表明單靠現(xiàn)有法規(guī)在把關乳制品雌激素安全問題上存在風險。同時也證明了該轉(zhuǎn)基因魚自由胚胎測試技術可作為一種快速可靠的乳制品雌激素安全篩查工具，防止因雌激素，特別是法規(guī)外的雌激素內(nèi)分泌干擾素污染而造成的乳制品安全隱患。

7 雌激素質(zhì)量分數(shù)測試于乳制品行業(yè)的應用前景

當明白內(nèi)源和外源雌激素都會對生物體造成相同的“有害結局”時，我們關注的不應該是乳制品中是否含有某種外源雌激素，而是乳制品中的雌激素總量是否達到對人體可能造成傷害的水平。根據(jù)有害結局路徑這一毒理學概念，本文提出了通過測量生物體的“有害結局路徑”中的敏感基因的表達量改變來量化乳制品的總體雌激素水平。從毒理學角度來講這種毒理評估方式比只分析某一種或幾種雌激素濃度更全面。根據(jù)國際食品法典委員會關于現(xiàn)代生物技術所產(chǎn)食品風險分析原則”（CODEX CAC/GL 44-2003），當和風險評估相關的新的科學信息可獲得時應進行評估和予以采納[21]。本文中所講述的轉(zhuǎn)基因鯖鱂魚自由胚胎測試雌激素當量技術正屬于“新的科學信息”，可用來有效測量和評估乳制品以及其它食品中的總體雌激素水平，從而幫助乳制品生產(chǎn)商和相關檢測部門發(fā)現(xiàn)雌激素安全隱患、采取措施、提升產(chǎn)品安全！至于乳制品中雌激素當量閾值設置為多少方可確保食用者安全這一問題則亟待進一步研究。

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