小麥黃色素含量與多酚氧化酶活性相關(guān)基因的分子標(biāo)記檢測及分布差異

陳泠+高春保+朱展望+佟漢文+劉易科+張宇慶+鄒娟+鮑文杰

摘要：用黃色素含量和多酚氧化酶活性相關(guān)分子標(biāo)記對277份國內(nèi)小麥（Triticum aestivum L.）品種（系）進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)1B/1R易位系出現(xiàn)頻率為27.1%，控制低多酚氧化酶（PPO）活性等位基因Ppo-A1b和Ppo-B1a分布頻率為53.1%和65.3%，控制低黃色素（YP）含量的等位基因Psy-A1b和Psy-B1b出現(xiàn)頻率分別是39.7%和55.6%。后4種基因型在各省份間分布頻率差異很大，等位基因Ppo-A1b在河南品種中頻率較低，為28.6%；Ppo-D1a基因型在陜西地區(qū)最低，為14.3%；Psy-A1b等位基因在河南和山東品種中分布頻率很低，僅為15.7%和13.3%；Psy-B1b在江蘇和山東地區(qū)較低，分別為25.0%和36.7%；四川品種中這4種等位基因出現(xiàn)頻率都較高。根據(jù)不同地區(qū)面粉色澤相關(guān)等位基因分布差異，制定適宜育種策略，能更有效地改善該地區(qū)小麥新品種的面粉色澤。

關(guān)鍵詞：小麥（Triticum aestivum L.）；黃色素含量；多酚氧化酶活性；1B/1R異位；分子標(biāo)記

中圖分類號：S512.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）24-4892-07

隨著生活水平的提高，人們對面制品外觀色澤的要求也越來越高。亮白到乳白的面制品，如饅頭、餃子、鹽白面條等更受到消費者的喜愛。黃色素（YP）含量和多酚氧化酶（PPO）活性都影響面制品的色澤，前者含量高使面制品呈現(xiàn)黃色，后者活性高導(dǎo)致面制品褐化，色澤變暗[1，2]。選育低YP含量和低PPO活性的小麥（Triticum aestivum L.）品種可有效增強(qiáng)面粉及面制品白亮色澤[3，4]，更受市場歡迎。

應(yīng)用分子標(biāo)記可快速篩選目標(biāo)基因，提高品種選育效率。研究表明，八氫番茄紅素合成酶（PSY）是面粉中黃色素物質(zhì)——類胡蘿卜素合成的一個關(guān)鍵酶，對面粉中的YP含量起著重要作用[5]。He等[6，7]開發(fā)了PSY基因的多個分子標(biāo)記，其中YP7A標(biāo)記可區(qū)分小麥7A染色體上Psy-A1a和Psy-A1b等位變異，分別控制高、低YP含量；YP7B-1和YP7B-2標(biāo)記可區(qū)分小麥7B染色體上的Psy-B1a、Psy-B1b和Psy-B1c等位基因，分別對應(yīng)中高、低和高YP含量。He等[6，7]還發(fā)現(xiàn)1B/1R易位的存在對YP含量起正相關(guān)作用，因此，通過篩選基因組中含等位基因組合Psy-A1b/Psy-B1b/non 1B/1R的材料，進(jìn)而可選出YP含量低的品種。PPO活性控制基因主要位于第2染色體組，Sun等[8]開發(fā)了2AL染色體上PPO活性基因的分子標(biāo)記PPO18，可區(qū)分PPO-A1a和PPO-A1b等位變異，分別控制高、低PPO活性。He等[9]開發(fā)了2DL染色體上的分子標(biāo)記PPO16和PPO29，可分別檢測低PPO活性等位變異PPO-1Da和高PPO活性等位基因Ppo-D1b。PPO活性基因等位變異組合中，含Ppo-A1b/Ppo-D1a組合的小麥品種，其PPO活性相對最低。

本研究利用與面粉及面制品色澤相關(guān)分子標(biāo)記YP7A、YP7B-1、YP7B-2、PPO18、PPO16、PPO29以及IB/1R易位系分子標(biāo)記[10]對277份小麥品種（系）進(jìn)行了檢測，分析了國內(nèi)小麥主產(chǎn)省間相關(guān)等位基因變異特點，以期為高白度色澤小麥品種的選育提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 材料

277份小麥品種（系）由湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所提供，分別來自河南、江蘇、湖北、山東、陜西、四川、北京、河北、山西、甘肅、寧夏和安徽等?。ㄊ校?，為近20多年來育成的品種（系），基本反映了各省市的品種特點。因后6省市各自的樣品數(shù)較少 （≤12），本研究中僅列出有關(guān)數(shù)據(jù)提供參考，不進(jìn)行比較分析。

1.2 葉片DNA的提取

材料種于湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所試驗田，2016年12月初取材，用CTAB法進(jìn)行葉片DNA的提取，詳細(xì)步驟見參考文獻(xiàn)[11]。每個品種（系）取不同3株小麥的葉片，結(jié)果一致的為準(zhǔn)確數(shù)據(jù)，3次結(jié)果不同的繼續(xù)取3株材料，以重復(fù)次數(shù)最多者為最終檢測結(jié)果。

1.3 分子標(biāo)記檢測

試驗所用分子標(biāo)記的相關(guān)信息見參考文獻(xiàn)[11]。PCR反應(yīng)體系為10 μL，含2×Es Taq Mater Mix （Dye） 5 μL（康為世紀(jì)生物科技有限公司）、20 μmol/L上下游引物各0.1 μL、10～50 ng DNA模板1 μL。PCR產(chǎn)物用含EB的1%瓊脂糖凝膠電泳后成像分析，YP7B-1標(biāo)記PCR產(chǎn)物1 μL經(jīng)12%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳后銀染分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 1B/1R異位系的分子標(biāo)記檢測

供試小麥材料分子標(biāo)記檢測結(jié)果見表1所示。對277份材料的1B/1R易位系分析結(jié)果（表2）表明，27.1%的材料為1B/1R易位系。其中河南和陜西材料中1B/1R易位系頻率較高，分別為34.3%和38.1%；江蘇、湖北和山東品種中1B/1R易位系出現(xiàn)頻率較低，分別為15.4%、15.2%和16.7%；四川省與總體頻率相當(dāng)。

2.2 PPO活性基因的分子標(biāo)記檢測

PPO18分子標(biāo)記可檢測Ppo-2A位點的2種基因型，即Ppo-A1a和Ppo-A1b；Ppo-2D位點有Ppo-D1a和Ppo-D1b基因型，分別由PPO16和PPO29分子標(biāo)記檢測。這兩個位點控制低PPO活性的基因型是Ppo-A1b和Ppo-D1a，出現(xiàn)頻率分別為53.1%和62.3%，后者比前者高近10%，均略高于相對應(yīng)控制高PPO活性的基因型頻率。低PPO活性Ppo-A1b和Ppo-D1a兩種等位基因在各省份品種中頻率差異較大，河南品種Ppo-A1b頻率很低，僅為28.6%，其他5省品種差異較小，頻率范圍為60.6%～65.0%。等位基因Ppo-D1a在陜西品種中頻率最低，只有14.3%，四川品種中頻率最高，為85.0%，山東中頻率為50%，河南、江蘇和湖北地區(qū)該等位基因頻率差異較小。endprint

2.3 YP含量相關(guān)基因分子標(biāo)記檢測

YP7A標(biāo)記可檢測7A位點2種基因型Psy-A1a和Psy-A1b，YP7B-1和YP7B-2分子標(biāo)記可檢測7B位點3種基因型Psy-B1a、Psy-B1b和Psy-B1c。其中等位基因Psy-A1b和Psy-B1b都與低YP含量相關(guān)，它們在277份材料中的出現(xiàn)頻率分別是39.7%和55.6%，而在各省間的頻率變化較大。Psy-A1b在河南和山東地區(qū)出現(xiàn)頻率最低，分別為15.7%和13.3%，在江蘇品種中頻率最高，為71.2%，在湖北、四川和陜西品種中頻率遞減，范圍為57.%～66.7%。等位基因Psy-B1b在江蘇品種中頻率卻最低，為25.0%，山東地區(qū)也較低，為36.7%。陜西和河南地區(qū)該基因型頻率較高，分別為81.0%和78.6%。

Psy-B1c基因型與高YP含量相關(guān)，該基因型在各地區(qū)小麥中的頻率都很低，出現(xiàn)頻率范圍為0～9.5%，供試材料中河南和四川品種中未檢測到該基因型。

2.4 等位變異組合分布情況分析

Ppo-2A和Ppo-2D位點基因型兩兩組合可形成4種組合類型，等位變異組合Ppo-A1b/Ppo-D1a的PPO活性最低，供試材料中該組合出現(xiàn)頻率為34.7%，高于4種組合類型的平均值25%。在各省份中，四川地區(qū)該組合頻率最高，達(dá)60.0%，而陜西品種頻率最低，為14.3%，與陜西品種中Ppo-D1a的出現(xiàn)頻率相同。Ppo-A1b/Ppo-D1a組合基因型在河南地區(qū)頻率為25.7%，與4種組合類型的平均值25%相當(dāng)，其他3省中該組合出現(xiàn)頻率都高于平均值25%。

PSY基因在7A位點的2種基因型和7B位點的3種基因型兩兩組合可形成6種組合類型，其中等位變異組合Psy-A1b/Psy-B1b對應(yīng)的YP含量最低，該組合在277份小麥品種（系）中出現(xiàn)頻率為22.2%，高于6種組合類型的平均值16.7%。在各省份中，低YP含量組合Psy-A1b/Psy-B1b在陜西地區(qū)頻率最高，為52.4%；四川和湖北次之，分別為50.0%和45.5%；山東地區(qū)最低，只有6.7%；河南和江蘇品種（系）中該組合頻率略低于6種組合類型的平均值16.7%。

組合類型Ppo-A1b/Ppo-D1a/Psy-A1b/Psy-B1b/non 1B/1R的YP含量和PPO活性相對最低，是篩選優(yōu)良色澤品種的最優(yōu)組合類型。供試材料中該組合類型出現(xiàn)頻率為5.8%，是組合類型平均值2.1%的2倍多；四川地區(qū)頻率最高，達(dá)25.0%；湖北次之，頻率為12.1%，山東品種中最低，未檢測到該組合類型。

3 小結(jié)與討論

通過對PPO活性和YP含量相關(guān)基因型的分子檢測，6個省份基因型的出現(xiàn)頻率差異很大。低PPO活性基因型Ppo-A1b出現(xiàn)頻率范圍為28.6%～65.0%，Ppo-D1a頻率范圍為14.3%～85.0%，其組合的基因型頻率范圍在14.3%～60.0%。低YP含量基因型Psy-A1b的頻率范圍為13.3%～71.2%，Psy-B1b的頻率范圍為25.0%～81.0%，其組合的基因型頻率范圍為6.7%～52.4%。因此，為了培育低PPO活性和低YP含量的小麥品種，不同地區(qū)在選育策略上可因地制宜。

河南品種中控制低PPO活性和低YP含量的4種基因型頻率非常有特點。Ppo-A1b頻率很低，為6個省份中最低，僅28.6%，而Ppo-D1a基因型頻率較高，為77.1%。該結(jié)果與左愛輝等[12]的報道較一致（文獻(xiàn)中Ppo-A1b為27.8%，Ppo-D1a為70.8%）。陳杰等[13]和楊子博等[14]的報道中也證實河南省品種Ppo-A1b頻率很低，分別為28.6%和19.8%，但這兩篇報道中Ppo-D1a的頻率低一些，分別為59.5%和56.0%。河南品種中低YP含量基因型Psy-A1b頻率很低，僅15.7%，但Psy-B1b的分布頻率較高，達(dá)78.6%。因此，河南地區(qū)在育種中需加強(qiáng)Ppo-A1b和Psy-A1b基因型的選擇，就能有效降低品種的PPO活性和YP含量。

江蘇品種中控制低PPO活性和低YP含量的4種基因型中，僅基因型Psy-B1b頻率為25.0%，在6個省份中墊底，其他3種基因型出現(xiàn)頻率都較高，分別為63.5%、73.1%和71.2%。Ppo-A1b和Ppo-D1a頻率比楊子博等[14]的報道要高些。該省Ppo-A1b/Ppo-D1a、Psy-A1b/Psy-B1b組合類型頻率以及non 1B/1R頻率都高于河南省，但其最優(yōu)組合類型Ppo-A1b/Ppo-D1a/Psy-A1b/Psy-B1b/non 1B/1R卻低于河南省。所以，江蘇品種在增加Psy-B1b基因型選擇的同時，需提高這些優(yōu)良等位基因的聚合。

湖北品種中1B/1R易位系頻率最低，僅15.2%。低PPO活性和低YP含量相關(guān)4種基因型的出現(xiàn)頻率都比較高，范圍為60.6%～69.7%，Ppo-A1b/Ppo-D1a和Psy-A1b/Psy-B1b組合類型頻率也較高，分別為42.4%和45.5%，只是最優(yōu)組合Ppo-A1b/Ppo-D1a/Psy-A1b/Psy-B1b/non 1B/1R的頻率稍低。因此，湖北品種可進(jìn)一步提高有利基因型的頻率，并加速這些基因型的聚合，從而增強(qiáng)品種色澤品質(zhì)。

山東品種中Ppo-A1b頻率為63.3%，與陳杰等[13]和楊子博等[14]的報道一致，但等位基因Ppo-D1a的頻率差異較大，本研究中結(jié)果為50.0%，兩篇報道中分別是35.5%和65.7%。山東品種中與低YP含量相關(guān)的Psy-A1b和Psy-B1b基因型出現(xiàn)頻率都很低，分別為13.3%和36.7%，造成Psy-A1b/Psy-B1b組合頻率僅6.7%。郭鳳芝[15]也證實山東品種Psy-A1b頻率很低，為16.67%，因此，山東品種需要著重提高Psy-A1b和Psy-B1b基因型頻率，同時Ppo-D1a基因型頻率也有待提高。endprint

陜西品種中Ppo-D1a頻率非常低，為14.3%。鄧彪等[16]和付曉潔等[17]的報道中也證實了陜西自育品種中Ppo-D1a的分布較少，頻率分別為32.43%和30.4%。但楊子博等[14]的報道中卻較高，為65.2%，推測這些差異跟供試材料選擇有關(guān)。Psy-A1b和Psy-B1b基因型在陜西品種中頻率較高，分別為57.1%和81.0%。與報道大體一致，頻率范圍在50.0%～67.4%[18，19]。陜西品種中1B/1R易位系頻率也較高，大大降低了最佳組合的出現(xiàn)頻率。因此，陜西地區(qū)需重點關(guān)注Ppo-D1a基因型頻率的提高，并降低易位系頻率，從而增加多個有利基因型的聚合。

四川品種中4種有利基因型的頻率都較高，特別是Ppo-D1a基因型頻率達(dá)85.0%。陳靜等[20]報道Ppo-D1a頻率為83.6%，與本研究結(jié)果一致。李式昭等[21]的報道中略低，分布頻率為74.3%?？梢娝拇ㄆ贩N中Ppo-D1a基因型頻率普遍較高。另外，Ppo-A1b、Psy-A1b和Psy-B1b基因型頻率在這兩篇報道中都低于本研究結(jié)果。4種有利基因型的聚合概率也較高，四川品種Psy-A1b和Psy-B1b基因型頻率都低于湖北品種，但Psy-A1b/Psy-B1b組合的頻率卻高于湖北品種。因此，對于四川品種，可進(jìn)一步提高Ppo-A1b、Psy-A1b和Psy-B1b基因型的頻率。

綜上所述，四川品種中與低PPO活性及低YP含量相關(guān)基因型頻率都較高，湖北省次之，其他4省各有需要著重選擇的基因型。各省可以根據(jù)上述品種色澤相關(guān)等位基因分布特點制定具體育種策略，并在提高有利基因型頻率的同時，加速有利基因型的聚合，才能更好地改善品種色澤，達(dá)到培育優(yōu)質(zhì)色澤品種的目的。

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