尼泊金酯作為防腐劑在芽孢桿菌中的應(yīng)用

陳偉+周榮華+廖先清+劉芳+張光陽+饒犇

摘要：研究了尼泊金酯作為防腐劑對(duì)蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）芽孢萌發(fā)的抑制作用和對(duì)伴孢晶體的影響。結(jié)果表明，尼泊金乙酯對(duì)蘇云金芽孢桿菌芽孢萌發(fā)有較強(qiáng)的抑制作用，在0.05%低劑量下即可有效抑制芽孢的萌發(fā)。SDS-PAGE分析和生物測(cè)定表明，尼泊金乙酯對(duì)伴孢晶體無顯著損傷作用，在0.10%條件下放置3周，發(fā)酵液毒力還保持在85%。

關(guān)鍵詞：尼泊金酯； 防腐劑； 蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）

中圖分類號(hào)：TS202.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2017）24-4782-02

尼泊金酯是一種廣譜性高效食品防腐劑，國(guó)際上廣泛應(yīng)用于調(diào)味品、糕點(diǎn)餡料、檳榔、乳制品、豆制品、肉制品、飲料、魚類制品、果蔬等食品的防腐保鮮[1-5]。尼泊金酯及其鈉鹽系列產(chǎn)品有尼泊金甲酯、尼泊金乙酯、尼泊金丙酯、尼泊金丁酯及尼泊金甲酯鈉、尼泊金乙酯鈉、尼泊金丙酯鈉、尼泊金丁酯鈉，均有良好的防腐效果[6-9]，具有防止發(fā)酵、抑制細(xì)菌增殖和殺菌能力，能夠鈍化酶的活性，阻止微生物新陳代謝的某些環(huán)節(jié)，在一定濃度下對(duì)一些微生物的生長(zhǎng)有抑制或者殺滅作用。在芽孢桿菌的水劑懸液中加入適當(dāng)?shù)哪岵唇瘐プ鳛榉栏瘎?，既可以阻止二次發(fā)酵，也能抑制一些雜菌的生長(zhǎng)，從而維持菌懸液的穩(wěn)定性。本試驗(yàn)研究尼泊金酯作為防腐劑對(duì)幾種常用的芽孢桿菌水劑產(chǎn)品的作用，為后續(xù)產(chǎn)品開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株：湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心研究室分離和保存的蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）。培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基（蛋白胨10 g，酵母浸粉5 g，NaCl 10 g）；發(fā)酵培養(yǎng)基（淀粉10 g，豆粕10 g，酵母粉5 g，玉米漿5 g，pH 7.2）。藥品：尼泊金乙酯、尼泊金丙酯、山梨酸鉀、苯甲酸鈉均購自國(guó)藥公司。

1.2 方法

發(fā)酵：將蘇云金芽孢桿菌接種至LB培養(yǎng)基，培養(yǎng)12 h后接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，當(dāng)菌體形成芽孢和晶體后，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

尼泊金酯處理芽孢：將一定量的尼泊金酯加入裝有10 mL的LB培養(yǎng)基的試管中，以未加尼泊金酯的試管作為對(duì)照。以1%比例接種各種芽孢桿菌的菌懸液，搖勻后30 ℃培養(yǎng)。每隔一段時(shí)間檢查芽孢的萌發(fā)情況；對(duì)芽孢沒有萌發(fā)的培養(yǎng)液稀釋涂平板，分析芽孢是否被殺死。

尼泊金酯處理蘇云金芽孢桿菌晶體：用天平稱取一定量伴孢晶體懸浮于1 mL無菌水中，加入尼泊金酯，以未加伴孢晶體作為對(duì)照，振蕩后30 ℃放置，進(jìn)行SDS-PAGE測(cè)定。

尼泊金酯防腐防霉試驗(yàn)：將一定量的芽孢桿菌發(fā)酵液裝入塑料瓶中，分別加入一定的尼泊金酯，45 ℃下放置，定期鏡檢雜菌生長(zhǎng)，觀察發(fā)酵液氣味變化，測(cè)定發(fā)酵液的毒力以及芽孢的情況。

生物測(cè)定：以經(jīng)驗(yàn)致死中濃度作為參照，將各處理發(fā)酵液以1.8倍稀釋成不同濃度菌懸液，晾干。以1齡末棉鈴蟲作為供試?yán)ハx，每個(gè)處理重復(fù)3次，每次接種30頭，另置清水對(duì)照，25 ℃培養(yǎng)，處理4 d檢查死、活蟲數(shù)，計(jì)算LC50。

2 結(jié)果與分析

2.1 尼泊金酯對(duì)芽孢桿菌芽孢的抑制作用

由表1可知，尼泊金乙酯在0.05%的劑量下 14 d內(nèi)可以抑制芽孢的萌發(fā)；在0.10%的劑量下30 d內(nèi)可以抑制芽孢的萌發(fā)。尼泊金丙酯則在0.05%的劑量下7 d內(nèi)可以抑制芽孢的萌發(fā)，0.10%的劑量下14 d內(nèi)可以抑制芽孢的萌發(fā)。作為對(duì)照，苯甲酸鈉在0.05%的劑量下7 d內(nèi)可以抑制芽孢的萌發(fā)，0.10%的劑量下14 d內(nèi)可以抑制芽孢的萌發(fā)。表明尼泊金乙酯對(duì)芽孢萌發(fā)的抑制作用較好。

為明確尼泊金乙酯是否將蘇云金芽孢桿菌殺死還是只是抑制芽孢萌發(fā)，將上述用尼泊金乙酯處理28 d的芽孢用無菌水反復(fù)洗滌離心多次，除去其中的尼泊金乙酯，將洗滌好的芽孢稀釋涂平板，30 ℃培養(yǎng)24 h。1 d后，芽孢萌發(fā)，說明尼泊金乙酯并未殺死芽孢本身；涂片和顯微鏡觀察，芽孢經(jīng)過處理后，萌發(fā)產(chǎn)生的芽孢及晶體形狀沒有發(fā)生改變，且芽孢與晶體的數(shù)量相當(dāng)，表明尼泊金乙酯未使蘇云金芽孢菌株發(fā)生變異。接著考察尼泊金乙酯對(duì)蘇云金芽孢桿菌伴孢晶體的作用，SDS-PAGE表明尼泊金乙酯對(duì)晶體無損傷作用。

2.2 尼泊金乙酯的防腐防霉能力

在前期研究尼泊金乙酯對(duì)蘇云金芽孢桿菌芽孢及其伴孢晶體基礎(chǔ)上，于50 ℃條件下放置，7 d后顯微鏡檢查，除發(fā)酵液空白對(duì)照外，未添加尼泊金乙酯的發(fā)酵液表面出現(xiàn)較多霉菌，而添加0.10%劑量尼泊金乙酯的發(fā)酵液未污染雜菌；14 d后，未添加尼泊金乙酯的發(fā)酵液已完全污染，而添加0.10%劑量尼泊金乙酯的發(fā)酵液正常，無污染出現(xiàn)；28 d后，未添加尼泊金乙酯的發(fā)酵液已發(fā)臭，鏡檢全部是霉菌和桿菌等雜菌，而處理過的發(fā)酵液正常，無異味散出。

2.3 尼泊金乙酯作為防腐劑Bt發(fā)酵液毒力穩(wěn)定性

生物測(cè)定添加尼泊金乙酯的蘇云金發(fā)酵液在50 ℃條件下的毒力變化情況。結(jié)果表明，添加0.05%尼泊金乙酯的發(fā)酵液毒力穩(wěn)定性一般，50 ℃下放置7 d后毒力保持率為80%，14 d后還有50%，21 d后則只有30%；而添加0.10%尼泊金乙酯的發(fā)酵液毒力穩(wěn)定性非常好，50 ℃下放置7 d后毒力保持率為95%，14 d后還有90%，21 d后則只有85%。

3 小結(jié)與討論

本研究結(jié)果表明，尼泊金乙酯在0.10%的劑量下可在30 d內(nèi)有效抑制蘇云金芽孢桿菌芽孢的萌發(fā)，但未殺死芽孢，有效防止了其二次發(fā)酵；SDS-PAGE分析表明，尼泊金乙酯對(duì)伴孢晶體并無明顯損傷作用，且毒力保持良好，是良好的蘇云金芽孢桿菌防腐劑，可以一定程度上代替苯甲酸鈉。

參考文獻(xiàn)：

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