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    胎兒非整倍體產(chǎn)前診斷的研究進展

    2018-01-27 20:12:33計德永王虎賈文娟方立異許克義
    中國現(xiàn)代醫(yī)生 2017年35期
    關(guān)鍵詞:產(chǎn)前診斷

    計德永+王虎+賈文娟+方立異+許克義

    [摘要] 產(chǎn)前診斷(prenatal diagnosis)是指在出生前對胚胎或胎兒的發(fā)育狀態(tài)、是否患有疾病等方面進行檢測診斷。通過遺傳咨詢,應(yīng)用現(xiàn)代分子生物學技術(shù),結(jié)合免疫遺傳學、細胞遺傳學、分子遺傳學等學科,通過母體檢查或?qū)ε咛ィㄌ海┲苯訖z測,了解胎兒在子宮內(nèi)的生長發(fā)育狀況,診斷胎兒是否有遺傳缺陷及先天畸形。本文就各種產(chǎn)前診斷方法、最新技術(shù)、存在的不足與困難及發(fā)展前景綜述如下。

    [關(guān)鍵詞] 產(chǎn)前診斷;胎兒細胞;熒光原位雜交技術(shù);光譜核型分析;胎兒游離DNA

    [中圖分類號] R714.5 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701(2017)35-0161-04

    [Abstract] Prenatal diagnosis refers to the detection and diagnosis of embryonic or fetal developmental state, and whether the fetus is suffering from diseases before birth. Through genetic counseling, disciplines such as modern molecular biology techniques, integrated immune genetics, cytogenetics and molecular genetics are applied. Through maternal examination or direct detection of the embryo (fetus), the growth and development status of the embryo in the uterus are understood, and whether the fetus has genetic defects and congenital malformations can be diagnosed. In this paper, a variety of prenatal diagnosis methods, the latest technology, existing shortcomings and difficulties, as well as development prospects are reviewed below.

    [Key words] Prenatal diagnosis; Fetal cells; Fluorescence in situ hybridization; Spectrometric karyotyping; Fetal free DNA

    我國是出生缺陷的高發(fā)國,據(jù)統(tǒng)計,每120~150個新生兒中就有一個染色體異常者,每年新增出生缺陷數(shù)約為90萬例,染色體病是最為嚴重的出生缺陷之一[1]。21-三體綜合征、18-三體綜合征、13-三體綜合征這三種是發(fā)病率較高的常染色體病,以非整倍體異常多見。其中21-三體綜合征在新生兒的發(fā)病率最高,約占1.2‰~1.7‰,21-三體和18-三體約占圍生期出生缺陷的0.15%,占圍生期常染色體非整倍體的95%左右[2]。染色體病患者大多伴有嚴重的智力發(fā)育障礙和嚴重的某些組織畸形等,且目前尚無有效的治療措施,因此加強產(chǎn)前診斷以便降低先天缺陷患兒出生率成為學者們研究的熱點。

    1 胎兒非整倍體的產(chǎn)前篩查方法

    1.1 孕婦年齡篩查

    孕婦妊娠唐氏綜合征胎兒的危險度與年齡呈正相關(guān),當孕婦年齡超過30歲后,危險度隨之升高,尤其是當孕婦年齡超過35歲時則被列為妊娠唐氏綜合征胎兒的高危人群。不同年齡孕婦妊娠唐氏綜合征胎兒的個體危險率可根據(jù)年齡相關(guān)危險率(age-speciflc risk,ASK)=1/[0.000627+exp(-16.2395+0.286×age)]-1公式進行計算。但是孕婦年齡篩查的陽性率不高,約為30%左右,因為約80%的妊娠均發(fā)生在年齡較輕的女性中。但孕婦年齡相關(guān)的危險度,仍被與多種血清指標或超聲聯(lián)合進行篩查[3]。

    1.2孕婦血清學篩查方法

    應(yīng)用于產(chǎn)前篩查的孕婦血清中的標記物從最初的AFP、hCG等已經(jīng)發(fā)展到目前的10多種,并且新的標記物在不斷的發(fā)現(xiàn)中[4]。單個的血清標記物作為篩查指標時存在準確性低,假陰性和假陽性的缺點,因此常采用多項指標的聯(lián)合篩查,從二聯(lián)、三聯(lián)到六聯(lián)、七聯(lián)不等。臨床上孕中期常使用AFP、β-hCG、μE3的三聯(lián)組合,能夠篩查出65%~75%的Down綜合征胎兒。1997年美國使用AFP、hCG、CA-125(或Inhibin-A),使陽性檢出率提高到90%。還有一些不斷探索中的血清標記物,如SP-1、PIGF、SOD、URNAP等[5]。

    1.3 超聲篩查

    高分辨超聲技術(shù)在產(chǎn)前篩查和產(chǎn)前診斷中應(yīng)用也越來越廣泛,不僅可以篩查胎兒有無明顯外在肢體畸形、胎兒神經(jīng)管缺陷外,還可運用超聲篩查唐氏綜合征[6]。常用的超聲篩查唐氏綜合征的指標有胎兒頸項透明帶厚度(NT)、胎兒雙頂徑與股骨長度之比、雙頂徑與肱骨長度之比。超聲測量胎兒頸項透明帶厚度(異常標準≥3.0 mm)在孕早期篩查唐氏綜合征陽性檢出率可達73%。有研究顯示若將超聲測量胎兒頸項透明帶厚度、妊娠相關(guān)血漿蛋白A(PAPP-A)、游離β-hCG和孕婦年齡4個參數(shù)聯(lián)合應(yīng)用,對孕10~14周唐氏綜合征的檢出率可達80%。此外,超聲發(fā)現(xiàn)羊水過多、十二指腸閉鎖、腎盂擴張或心臟異常均提示唐氏綜合征的風險升高,且多項指標異常提示患兒的風險更大[7]。

    2 胎兒非整倍體的產(chǎn)前篩查最新方法

    2.1 細胞遺傳學產(chǎn)前診斷方法

    絨毛組織檢查孕早期絨毛組織檢查常在孕7~9周進行,在超聲監(jiān)測下,從胎盤邊緣取少量絨毛組織做染色體核型分析,絨毛既可以培養(yǎng)后做也可直接做核型分析,此方法優(yōu)點是將產(chǎn)前診斷的時間提早到孕早期,缺點是診斷的可靠性不如羊水細胞,另外引起流產(chǎn)和感染的風險比較高[8]。endprint

    羊水穿刺常規(guī)羊膜腔穿刺術(shù)通常在16~20周進行,最佳穿刺時間為18~20周,此時子宮已出盆腔,羊水量達250 mL,穿刺不易傷及胎兒,且羊水中有活力的細胞比例最高,結(jié)果更可靠。缺點是產(chǎn)前診斷的時間比較晚,同樣是有創(chuàng)的,有引起感染和流產(chǎn)的風險。但羊水穿刺診斷染色體異常的可靠性超過99%[9]。

    臍血細胞檢查臍血穿刺常在孕早期沒有做絨毛膜抽吸術(shù)、孕中期沒有做羊水穿刺,在孕期稍晚時選用。此法可以直接檢測胎兒的染色體有無異常,準確性高,但是反復(fù)的臍帶穿刺可致穿刺點出血造成胎兒急性貧血,嚴重者可致胎兒及新生兒死亡[10]。

    細胞遺傳學檢查,隨著技術(shù)的發(fā)展,安全性較以前有所提高,但仍有出血、感染和流產(chǎn)的風險,作為侵入性的有創(chuàng)檢查手段,對母親和胎兒的危險性約為1/500~1/1000,甚至可能造成胎兒的丟失,報告結(jié)果出來的時間比較長,但是此類檢查的精密度和準確性高,目前仍為產(chǎn)前診斷的金標準[11]。

    2.2 分子遺傳學產(chǎn)前診斷方法

    熒光原位雜交(FISH)技術(shù)采用染色體區(qū)帶上特異性的DNA經(jīng)熒光標記后作為探針,與分裂期或間期細胞原位雜交后,通過熒光顯微鏡來觀察染色體畸變的技術(shù)[12]。最常采用的13、18、21、X與Y染色體這5個探針,可篩查出約80%~90%的主要染色體病。FISH技術(shù)不受細胞周期的影響,間期細胞即可作為標本,因此周期大大縮短,在24~48 h內(nèi)可完成快速診斷。但是FISH技術(shù)檢測成本較高,也更耗費人力,無法一次性將所有染色體進行分析,容易漏檢某些結(jié)構(gòu)性染色體重排。

    定量熒光多聚酶鏈式反應(yīng)(QF-PCR)技術(shù)是將被檢測的標本DNA采用熒光引物PCR方法,擴增特異重復(fù)的DNA序列,即短串聯(lián)重復(fù)序列(STRs),應(yīng)用自動化DNA測序儀和基因掃描軟件檢測額重復(fù)序列長度得到峰面積值而實現(xiàn)定量。該技術(shù)近年來在歐洲的快速產(chǎn)前診斷中應(yīng)用的越來越廣泛[13],具有快捷、方便、省時省力的優(yōu)點,檢測結(jié)果可在標本收集的24~48 h內(nèi)得到,這一點對于早期妊娠異常的及時處理極為有利。但該方法檢測結(jié)果正常仍然不能排除染色體畸形的風險,并且無法檢測出染色體嵌合型和易位型[14]。

    光譜核型分析技術(shù)(SKY)是應(yīng)用在多個光譜上有重疊的染色體涂染探針與中期染色體進行原位雜交,對其發(fā)射光譜的所有信息進行分析的一項技術(shù)。該技術(shù)的優(yōu)點是可以同時對24條染色體分別用不同的探針進行涂染,然后在熒光顯微鏡下獲得不同顏色的24條染色體的圖像并進行光譜分析[15]。但是該技術(shù)成本昂貴,無法在臨床大規(guī)模推廣。同時對于染色體的微小缺失、重復(fù)及插入依然容易漏診。

    2.3孕婦外周血中胎兒有核紅細胞用于檢測染色體非整倍體疾病

    1960年在孕婦外周血中發(fā)現(xiàn)男胎的細胞分裂相,提出了母血中可能存在胎兒細胞的假說。隨著在1979年首次從孕婦血中分離出胎兒細胞,此后的研究主要針對胎兒的有核紅細胞的分離,因為它攜帶了胎兒基因組DNA的全部遺傳信息。但是胎兒細胞在孕婦外周血中含量非常稀少,且富集技術(shù)價格昂貴、效率低、靈敏度也不高,在一定程度上限制了它的應(yīng)用和發(fā)展[17]。

    2.4 孕婦外周血中胎兒游離DNA在無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷染色體非整倍體疾病

    1997年,Lo M等[8]在懷有男胎的孕婦外周血中檢測出胎兒Y染色體特異性的DNA序列,這對無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷方法的改進產(chǎn)生了巨大的影響。胎兒游離DNA最早可能在懷孕5周后的母血中測出,母血中胎兒游離DNA可能來源于進入母體的胎兒細胞受到母體免疫系統(tǒng)的攻擊而發(fā)生溶解后釋放所得,或是胎兒發(fā)育過程中細胞凋亡后DNA釋放出來而進入母血中[18]。研究發(fā)現(xiàn),懷有染色體非整倍體胎兒的孕婦,其外周血中胎兒游離DNA的濃度高于懷有正常胎兒的孕婦,但在孕11~17周,母體的游離DNA占絕大多數(shù),胎兒的游離DNA含量只占母血漿DNA總含量的3.4%(0.39%~11.9%)左右[19]。如何提取胎兒DNA和減少母源性的DNA的干擾,就需要增加提取的胎兒DNA濃度或抑制母體DNA濃度,減少背景DNA[20]。有研究顯示[21],母血中胎兒DNA分子一般比母體DNA分子要短,絕大多數(shù)不超過313bp,而母體的DNA分子長度一般在1000bp以上。另外,母親與胎兒的DNA的甲基化存在差異性[22],如18號染色體上的mapsin基因、3號染色體上的rassfla基因、21號染色體上的aire、erg和hlcs基因及DSCR4基因可以區(qū)分母體核酸,排除其干擾。

    3 存在的困難和不足

    產(chǎn)前診斷是我國母嬰保健工程的重要組成部分,可以有效降低先天缺陷患兒的出生率。產(chǎn)前基因診斷是現(xiàn)代醫(yī)學的一個新分支,與臨床各科室都有密切的聯(lián)系,產(chǎn)前診斷的技術(shù)發(fā)展也是日新月異[23]。目前我國產(chǎn)前診斷還面臨著一些困難和不足:①缺乏完善的科室配置。目前,除了一些較大的綜合醫(yī)院和??漆t(yī)院外,大部分醫(yī)院都沒有開展產(chǎn)前診斷的實驗室。有的實驗室設(shè)在科研院所,造成了臨床和實驗室難以協(xié)調(diào)。②缺乏合格的專業(yè)人員。產(chǎn)前診斷橫跨很多學科,涉及的技術(shù)多樣,需要特殊的技術(shù)培訓,一般的臨床醫(yī)生很難通過短期培訓達到預(yù)期目的。③產(chǎn)前診斷是高風險的項目。不同于一般的檢驗項目,國內(nèi)也缺乏相應(yīng)的保護機制。④產(chǎn)前診斷的收費定價太低。⑤缺乏資金的支持。產(chǎn)前診斷最主要的任務(wù)是減少出生缺陷,提高全民族素質(zhì)。它是一項科技含量高、投入高的項目,且?guī)в泄嫘缘奶攸c,由于管理部門對其重要性認識不足,導(dǎo)致資金投入不足。⑥宣傳教育不足。一方面患者對產(chǎn)前診斷缺乏了解,仍然有盲目生育的現(xiàn)象,另一方面,許多臨床醫(yī)生缺乏對產(chǎn)前診斷相關(guān)技術(shù)的了解,不能正確的進行遺傳咨詢。

    4 發(fā)展前景

    產(chǎn)前診斷的方法眾多,不同的診斷方法各具特點[24]。目前多數(shù)的產(chǎn)前診斷需做侵入性的檢查,對孕婦和胎兒有一定的創(chuàng)傷和風險。隨著產(chǎn)前診斷技術(shù)的不斷發(fā)展,人們對產(chǎn)前診斷的認識也在不斷提高,同時新的診斷技術(shù)也不斷應(yīng)用于臨床。相對于侵入性的產(chǎn)前診斷技術(shù),分子遺傳診斷技術(shù)是在基因水平進行的[25],樣本量少、非特異,敏感性高,可在孕早中期進行診斷。相信隨著分子生物學技術(shù)和分子遺傳學技術(shù)的不斷發(fā)展和創(chuàng)新,高精確度、低成本、省時省力的檢測手段在不久的將來將服務(wù)于臨床。endprint

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    (收稿日期:2017-11-12)endprint

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