干巴菌物種復(fù)合群與云南松形成的外生菌根形態(tài)特征及分子鑒定*

魏杰，楊岳，李樹紅，張小雷，蘇開美**

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特010018；2.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所，云南昆明650223）

干巴菌（Thelephora ganbajun）屬于擔(dān)子菌亞門（Basidiomycotina）層菌綱（Hymenomycetes）非褶菌目（Aphyllophorales）革菌科（Thelephoraceae）革菌屬（Thelephora）的一類真菌[1]。革菌屬為世界廣布屬，Corner于1968年在其革菌屬世界性專著中共報(bào)道51種[1]。我國(guó)目前的報(bào)道中有16種，其中云南產(chǎn)11種[2]。

干巴菌子實(shí)體呈扇狀或蓮座狀瓣片，全菌干燥革質(zhì)，在我國(guó)云南所指“干巴菌”一名，實(shí)際包括多種革菌類[3]。據(jù)報(bào)道，云南市場(chǎng)上的干巴菌主要有6種，即蓮座革菌（Thelephora vialis Schw.）、橙黃革菌（T.aurantiotincta Corner.）、日本革菌（T.japonicaYasuda）、淡褐革菌[T.fuscella(Ces.)Lloyd]、掌狀革菌[T.palmata(Scop.)Fr.]和干巴菌（T.ganbajunM.Zang）[2，4-5]。

干巴菌子實(shí)體與松科植物形成共生關(guān)系，多生于松林下。國(guó)外對(duì)革菌屬Thelephora真菌的外生菌根研究較多，其中以T.terrestrisEhrh.的研究最多[6-8]。我國(guó)對(duì)Thelephora屬真菌的外生菌根研究不多，目前為止僅對(duì)干巴菌的菌根做過(guò)初步研究。敬一兵[9-10]調(diào)查發(fā)現(xiàn)干巴菌的菌根顏色為灰白色至黑褐色，形狀是珊瑚狀至連續(xù)二叉式分枝狀，但沒有對(duì)干巴菌菌根的解剖結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究。朱啟順和楊大智[11]不僅觀察了干巴菌菌根的外部形態(tài)結(jié)構(gòu)，同時(shí)還對(duì)干巴菌的菌套特征進(jìn)行了描述，但是，他們都沒有對(duì)該菌根進(jìn)行分子鑒定。

Sha等[12]對(duì)中國(guó)西南地區(qū)干巴菌的遺傳多樣性進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，干巴菌可能是1個(gè)種的集群，包含了很多隱存種。干巴菌可與云南松（Pinus yunnanensisFranch.）、思茅松[P.kesiyaRoyle ex Gord.var.langbianensis(A.Chev.)Gaussen]和滇油杉（Keteleeria evelynianaMast.）具有非專一性密切的共生關(guān)系[2]。因此，干巴菌形成的菌根形態(tài)類型也可能有很多種，這就需要對(duì)干巴菌的外生菌根進(jìn)行廣泛的研究。

本文根據(jù)Agerer的外生菌根描述，系統(tǒng)詳細(xì)描述了干巴菌與云南松形成的外生菌根的外部形態(tài)和內(nèi)部解剖結(jié)構(gòu)特征，并首次運(yùn)用分子生物學(xué)方法進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育分析。

1 材料與方法

1.1 干巴菌子實(shí)體和菌根采集方法

1.1.1 子實(shí)體和菌根采集地點(diǎn)

本研究中干巴菌子實(shí)體（如圖1A所示）和菌根，采自云南省昆明市宜良縣狗街鎮(zhèn)小哨村云南松林中，干巴菌生長(zhǎng)林地的土壤是紅壤，成林樹種是云南松，林下有少量杜鵑和野胡椒等。

1.1.2 子實(shí)體和菌根采樣

尋找到干巴菌子實(shí)體后拍照并記錄生境，用小刀切取一部分干巴菌子實(shí)體用于分子鑒定。為了保護(hù)干巴菌的菌塘，在子實(shí)體基部外圍1 cm～30 cm的土壤內(nèi)，沿著云南松的根系尋找側(cè)根。小心找到干巴菌子實(shí)體基部根狀菌索，并順著根狀菌索用鑷子輕輕剝離土壤尋找外生菌根。用枝剪剪下帶有外生菌根的側(cè)根并用泥土包裹裝袋并進(jìn)行編號(hào)，將子實(shí)體和外生菌根帶回實(shí)驗(yàn)室。

1.1.3 子實(shí)體和菌根處理

將新鮮子實(shí)體放入冰箱內(nèi)冷藏用于分子鑒定。把采集到的帶有側(cè)根的土壤用自來(lái)水浸泡20 min后，在OLYMPUS SZX16體式顯微鏡下用解剖針或者鑷子挑去粘在菌根上的泥土雜物，并用小刷子清洗。將洗干凈的側(cè)根放到干凈的盛水培養(yǎng)皿中在解剖鏡下觀察。

1.1.4 菌根形態(tài)觀察

用鑷子挑取菌根系統(tǒng)的1個(gè)未分支末端，放在滴有1滴水的載玻片上，在解剖鏡下用鑷子夾住未分支末端的根部，用鋒利的解剖針剝下菌套，壓片，在Nikon ECLPSE 80i顯微鏡下觀察并描述菌套特征，并用Nikon Y-Tv55照相。菌套描述按照Agerer的描述系統(tǒng)。剩余的菌根用FAA固定液和CTAB分別保存，用于以后的觀察和分子生物學(xué)鑒定[13-15]。

1.2 分子鑒定

干巴菌子實(shí)體和菌根的DNA提取，采用Ezup柱式基因組DNA抽提試劑盒（植物），生工生物工程（上海）有限公司。PCR擴(kuò)增反應(yīng)在Eppendorf Maseter cycler PCR儀上進(jìn)行。50 μL的PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系組成包括：25 μL 2×Power Taq PCR MasterMix（北京百泰克生物技術(shù)有限公司），引物ITS1F和ITS4各2 μL，DNA模板1 μL，加雙蒸水補(bǔ)足50 μL。擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性40 s，57℃退火1 min，72℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；72℃后延伸10 min。PCR產(chǎn)物的純化和測(cè)序交由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。序列的編輯采用bioedit完成。

將該干巴菌子實(shí)體和菌根的序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行比對(duì)（BLAST），將同源性最高的序列下載下來(lái)作為參考。并根據(jù)王鵬飛[16]的研究，將干巴菌模式標(biāo)本序列和近似系統(tǒng)種序列都下載下來(lái)用于本研究的系統(tǒng)發(fā)育分析中。使用MEGA軟件（v7.0.14）進(jìn)行Alignment，然后使用Phylogenetic Analysis中的Construct/Test Neighbor-Joining（NJ）鄰接法，將Bootstrap設(shè)為1 000次進(jìn)行建樹，最后對(duì)所建系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行調(diào)整并保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 干巴菌外生菌根形態(tài)和解剖結(jié)構(gòu)特征

干巴菌外生菌根形態(tài)和解剖結(jié)構(gòu)特征見圖1。

2.1.1 形態(tài)特征

菌根系統(tǒng)二叉分支（0～5級(jí)），親水。未分支末端直，幼時(shí)黃色，老時(shí)棕褐色，長(zhǎng)4 mm～7.6 mm，直徑3.5 mm～4.8 mm，表面光滑，有少量的外延菌絲，成稀疏的羊毛狀（如圖1B所示）。

圖1 干巴菌隱存種子實(shí)體及外生菌根的形態(tài)和解剖結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Fruitbody of cryptic species of Thelephoraganbajun,morphology and anatomy of ectomycorrhizae

2.1.2 解剖結(jié)構(gòu)特征

菌套表面有菌絲網(wǎng)，由膨大的細(xì)胞連接形成（如圖1C所示），菌絲細(xì)胞直徑4 μm～8 μm。外層菌套為密絲組織，菌絲無(wú)色，直徑3 μm～8 μm，細(xì)胞壁薄，有些菌絲有鎖狀聯(lián)合（如圖1D所示）。中層菌套為密絲組織，菌絲無(wú)色，直徑3 μm～5.5 μm，有些菌絲有鎖狀聯(lián)合（如圖1E所示）。內(nèi)層菌套也為密絲組織，菌絲無(wú)色，直徑3 μm～5.5 μm，有些菌絲有鎖狀聯(lián)合（如圖1F所示）。

外延菌絲無(wú)色，直徑4.5 μm～5.5 μm，細(xì)胞壁薄，菌絲表面光滑。分支多，分支處有鎖狀聯(lián)合（如圖1G所示）。菌絲有接合現(xiàn)象，接合處無(wú)隔或無(wú)鎖狀聯(lián)合，呈“H”型（如圖1H所示）。

2.2 干巴菌外生菌根分子鑒定結(jié)果

基于ITS片段構(gòu)建的革菌系統(tǒng)發(fā)育樹見圖2。

由圖2可知，以Tomentella stuposa做外類群，用NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，本研究中的干巴菌子實(shí)體及外生菌根序列與5個(gè)干巴菌子實(shí)體序列聚在一起，形成1個(gè)獨(dú)立的分支clade1，且bootstrap為100%。同時(shí)還有2個(gè)干巴菌序列EU696827和EU696946形成1個(gè)獨(dú)立分支clade2，bootstrap為87%。

圖2 基于ITS片段構(gòu)建的革菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 ITS phylogenetic tree of Thelephora

3 討論

在革菌屬中，至今描述最多的是T.terrestris的外生菌根，它的形態(tài)結(jié)構(gòu)具有如下特征：菌根帶褐色的，親水；菌套屬于D型，即外層菌套為密絲組織且?guī)в绣F狀的囊狀體；根狀菌索為thelephoroid，即根狀菌索的菌絲有輕微區(qū)別，外圍菌絲的直徑要小于中間菌絲；外延菌絲有鎖狀聯(lián)合，菌絲接合處為“H”型[17]。本研究中的菌根與T.terrestris菌根的共同之處在于：菌根呈褐色，親水；均具有密絲組織的菌套；外延菌絲有鎖狀聯(lián)合，且菌絲接合處無(wú)隔或無(wú)鎖狀聯(lián)合。但也存在不同之處：本研究中的菌根菌套表面由膨大的細(xì)胞連接形成菌絲網(wǎng)，無(wú)典型的錐狀囊狀體，且基部有鎖狀聯(lián)合的囊狀體是最大的不同之處。

本研究中菌根具有二叉分支，菌根呈黃褐色，外層、中層和內(nèi)層菌套為密絲組織，菌絲有鎖狀聯(lián)合且有“H”型的菌絲細(xì)胞接合現(xiàn)象，與朱啟順和楊大智對(duì)T.ganbajun菌根的觀察結(jié)果相同[11]。但本研究中觀察到的菌套表層具有由膨大細(xì)胞形成的菌絲網(wǎng)，這在他們的研究中未提及。

系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，該菌根序列與本研究采集的干巴菌子實(shí)體序列以及5個(gè)定名為干巴菌的序列在1個(gè)獨(dú)立分支clade1中，且bootstrap值非常高。但這5個(gè)序列都非源自干巴菌模式標(biāo)本。雖然王鵬飛等[16]通過(guò)不懈的努力后獲得了干巴菌模式標(biāo)本的ITS序列，但是在GeneBank中沒有找到該序列，因此本研究中并沒有加入干巴菌模式標(biāo)本序列。但在他的研究中有2個(gè)序列，即EU696827和EU696946與模式標(biāo)本的ITS序列形成1個(gè)獨(dú)立分支，這兩個(gè)序列在本研究中也形成一個(gè)獨(dú)立分支clade2。Sha等把未與干巴菌（Thelephora ganbajun）模式標(biāo)本序列形成單系分支的干巴菌定義為干巴菌的隱存種[12，16]。因此，本研究中的菌根是由干巴菌隱存種與云南松形成的外生菌根。

Sha等[12，16]的研究還認(rèn)為目前分布在云南地區(qū)（除普洱地區(qū)）被認(rèn)為是干巴菌的真菌，很可能是Tomentella屬的1個(gè)或幾個(gè)新種[12]。目前的菌根研究結(jié)果表明，除Tomentella ferruginea和Tomentella brunneorufa具有密絲組織的外層菌套外，絕大多數(shù)已研究的Tomentella形成的菌根具有擬薄壁組織結(jié)構(gòu)的外層菌套。謝雪丹和劉培貴[18]對(duì)云南松6個(gè)棉革菌外生菌根進(jìn)行了形態(tài)和解剖結(jié)構(gòu)觀察，所有6個(gè)Tomentella外生菌根的外層菌套均為擬薄壁組織。外層菌套結(jié)構(gòu)不是唯一鑒定Thelephora和Tomentella的標(biāo)準(zhǔn)，隨著解剖結(jié)構(gòu)特征結(jié)合分子生物學(xué)方法的發(fā)展，外生菌根的形態(tài)研究也許可以為Thelephora-Tomentella真菌的分類提供一些依據(jù)，并為發(fā)現(xiàn)“T.ganbajun”的隱存種提供線索。

[1]Corner EJH.A monograph ofThelephora[M].Nova Hedwigia:Beihefte zur Heft,1968.

[2]桂明英，劉蓓，朱萍，等.干巴菌生態(tài)學(xué)初步研究[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2005，18（3）：325-327.

[3]臧穆.干巴菌[J].食用菌，1986，8（4）：1-2.

[4]邰麗梅，趙春艷，郭相，等.云南幾類野生食（藥）用菌資源開發(fā)應(yīng)用前景[J].中國(guó)食用菌，2013，32（2）：4-6.

[5]于富強(qiáng)，肖月芹，劉培貴.云南松（Pinus yunnanensis）林外生菌根真菌的時(shí)空分布[J].生態(tài)學(xué)報(bào)，2007，27（6）：2325-2333.

[6]Agerer R.Studies on ectomycorrhizae XVII.The ontogeny of the ectomycorrhizal rhizomorphs ofPaxillus involutusandThelephora terrestris[J].Nova Hedwig,1988（47):311-334.

[7]Ingleby K,Mason PA.Ectomycorrhizas ofThelephora terrestrisformed withEucalyptus globulus[J].Mycologia（88):548-553.

[8]Mohan V,Natarajan K,Ingleby K.Anatomical studies on ectomycorrhizas.I.The ectomycorrhizas produced byThelephora terrestrisonPinus patula[J].Mycorrhiza,1993,3(1):39-42.

[9]敬一兵，張玲琪.干巴菌菌根的觀察研究[J].林業(yè)科技通訊，1987（2）：22-23.

[10]敬一兵.干巴菌--云南松外生菌根菌的研究[J].云南林業(yè)科技，1987（3）：40-45.

[11]朱啟順，楊大智.干巴菌外生菌根及菌絲的觀察[J].中國(guó)食用菌，1996，15（6）：11-12.

[12]Sha T,Xu JP,Palanichamy MG et al.Genetic diversity of the endemicgourmetmushroomThelephoraganbajunfrom southwestern China[J].Microbiology,2008,154(11):3460-3468.

[13]Agerer R.Colour atlas of ectomycorrhizae[M].Einhorn,Schw bisch Gmünd:1st-14th Delivery,1987-2008.

[14]Agerer R.Characterization of ectomycorrhizae[J].Methods in Microbiology,1991,23(4):25-73.

[15]Agerer R,Rambold G.DEEMY-An information system for characterization and determination of ectomycorrhizae(2004-2017)[EB/OL].(2011-01-10)[2017-09-01].www.deemy.de.

[16]王鵬飛.Thelephora-Tomentella分子系統(tǒng)發(fā)育分析及干巴菌（Thelephora ganbajun）群體遺傳學(xué)和線粒體異質(zhì)性研究[D].昆明：云南大學(xué)，2015.

[17]Agerer R.Fungal relationships and structural identity of their ectomycorrhizae[J].Mycological Progress,2006,5(2):67-107.

[18]謝雪丹，劉培貴.云南松幼苗棉革菌屬菌根真菌的物種多樣性[J].菌物研究，2011，9（4）：224-243.