叢倩倩，蘭玉菲，崔曉，安秀榮

（泰安市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，山東泰安271000）

平菇（Pleurotus ostreatus），又名糙皮側(cè)耳，隸屬于真菌門擔(dān)子菌綱（Basidiomycetes）傘菌目（A-garicales）側(cè)耳科（Pleurotaceae）側(cè)耳屬（Pleurotus），是我國栽培面積最廣泛的食用菌之一[1]。平菇營養(yǎng)物質(zhì)豐富，適應(yīng)性強(qiáng)，栽培成本低，周期短，且栽培原料能就地取材，可為栽培者帶來良好的經(jīng)濟(jì)效益。但是，在平菇菌種生產(chǎn)種植過程中可能會受到一些病毒的侵染，導(dǎo)致子實體畸形，品質(zhì)下降，產(chǎn)量降低甚至絕收[2]。

病毒的檢測和診斷是預(yù)防和控制病毒病害的關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)，對生產(chǎn)實踐具有重要的指導(dǎo)意義。相對于其他作物病毒病害的研究，食用菌病毒病害的研究范圍較窄，研究基礎(chǔ)較為薄弱。目前，對食用菌病毒的檢測和鑒定通常采用電鏡法[3-4]、血清學(xué)方法[5-6]、dsRNA技術(shù)[7-10]、PCR[11-12]等。上述方法僅在對病原物特征有預(yù)先了解的情況下使用，而在對病原物了解缺乏的情況下，這些檢測方法的使用就受到了極大的限制。

應(yīng)用siRNA高通量測序技術(shù)鑒定病毒是近幾年快速發(fā)展起來的一項技術(shù)。在病毒與寄主的互作中，病毒復(fù)制產(chǎn)生的雙鏈RNA（dsRNA）可以被寄主體內(nèi)Dicer酶切割成大量針對入侵病毒的小干擾RNA（siRNA）[13-14]。siRNA分子量較小，長度為20 nt～25 nt，很容易與細(xì)胞中的其他RNA區(qū)分，因此可以利用高通量測序技術(shù)對病毒產(chǎn)生的siRNA序列進(jìn)行測序，并利用軟件對測序結(jié)果進(jìn)行組裝，組裝結(jié)果與數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對來鑒定和發(fā)現(xiàn)新病毒[15-18]。

本研究利用siRNA高通量測序技術(shù)，檢測疑似被病毒侵染的平菇樣品中是否攜帶病毒，旨在為其他種類食用菌的病毒檢測鑒定提供借鑒和參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

平菇樣品采集于山東省聊城市鄭家鎮(zhèn)，樣品表現(xiàn)癥狀為子實體球形變小，菌蓋黃褐色，見圖1。

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取與質(zhì)量檢測

圖1 平菇樣品癥狀Fig.1 Sample symptoms of Pleurotus ostreatus

將5個平菇樣品混合后，采用Trizol法提取總RNA?？俁NA用干冰保存，送往北京諾禾致源生物信息科技有限公司進(jìn)行測序。測序前需對RNA的質(zhì)量進(jìn)行檢測，包括：分析RNA是否降解及其是否有污染，檢測RNA的純度和完整性，精確定量RNA的濃度。

1.2.2 文庫的構(gòu)建

樣品檢測合格后，使用Small RNA Sample Pre Kit構(gòu)建cDNA文庫。

1.2.3 測序數(shù)據(jù)過濾

構(gòu)建好的文庫利用Illumina HiSeqTM 2000進(jìn)行測序。為了保證分析質(zhì)量，必須對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾，去除接頭序列和低質(zhì)量的讀段（reads），得到干凈的讀段（clean reads），最后選取18 nt～26 nt的reads來進(jìn)行后續(xù)分析。

1.2.4 siRNA的序列拼接和候選病毒篩選

所得的序列去除3’接頭，然后分別利用PFOR（參數(shù)為-x4）和Velvet（參數(shù)為k-mer 17）軟件對篩選所得siRNA進(jìn)行序列拼接，獲得較長的重疊群（contigs）。首先將拼接所得的contigs與寄主基因組數(shù)據(jù)庫（Host Genome）進(jìn)行比對，除去寄主的基因組序列，然后將剩余的contigs用BLASTN與核酸數(shù)據(jù)庫（NCBI Nt）進(jìn)行比對，尋找與這些contigs高度同源的序列，再然后用BLASTX將沒有找到高度同源序列的contigs與蛋白數(shù)據(jù)庫（NCBI Nr）進(jìn)行比對，尋找與contigs部分同源的序列，最后將與contigs高度同源序列和部分同源序列分別與病毒核酸數(shù)據(jù)庫（Virus RefSeq Nucleotide）和病毒蛋白數(shù)據(jù)庫（Virus RefSeq Protein）進(jìn)行比對，篩選出和病毒序列同源的contigs，從而得到候選病毒。比對采用參數(shù)限制e期望值（e-value）（1e-6 for BLASTN，1e-4 for BLASTX）。

1.2.5 PCR驗證

根據(jù)所得候選病毒，設(shè)計特異性引物分別進(jìn)行擴(kuò)增以進(jìn)一步驗證測序結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果與分析

2.1 平菇樣品總RNA質(zhì)量分析

平菇樣品總RNA質(zhì)量分析結(jié)果見表1，檢測結(jié)果合格，符合建立cDNA文庫的要求。

表1 平菇樣品總RNA質(zhì)量分析Tab.1 Quality analysis on total RNA of Pleurotus ostreatus

2.2 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量情況

對siRNA測序結(jié)果進(jìn)行分析，去除接頭序列和低質(zhì)量的讀段，測序得到的數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果見表2。

對數(shù)據(jù)庫的測序質(zhì)量進(jìn)行評估，其中干凈的讀段占總讀段的百分比達(dá)到了95%以上，表明測序質(zhì)量較高，達(dá)到信息分析的要求。

2.3 siRNA的拼接與注釋

5個數(shù)據(jù)庫所注釋的contigs維恩圖和結(jié)果統(tǒng)計見圖2和表3。

從clean reads中篩選長度18 nt～26 nt的siRNA來進(jìn)行后續(xù)分析，經(jīng)長度篩選后所得的總reads數(shù)為2 749 087。使用PFOR軟件和velvet軟件對篩選的siRNA進(jìn)行序列拼接，得到總的重疊群數(shù)為479，將拼接所得的contigs分別與Host Genome、NCBI Nr、NCBI Nt、Virus RefSeq Nucletide和Virus RefSeq Protein五個數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)被Host Genome注釋所得的contigs數(shù)為85，未被Host Genome而只被NCBI Nr和NCBI Nt注釋的contigs數(shù)分別為5和17，被Virus RefSeq Nucleotide和Virus RefSeqProtein注釋所得的contigs數(shù)分別為2和7。

表2 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量統(tǒng)計Tab.2 Quality statistics of sequencing data

圖2 5個數(shù)據(jù)庫所注釋的contigs維恩圖Fig.2 Contigs Venn diagrams annotated by 5 databases

2.4 候選病毒檢測結(jié)果

在以上分類注釋結(jié)果中分離與病毒相關(guān)的con tigs，其病毒檢測結(jié)果見表4。

從結(jié)果可以看出，文庫中檢測到8種候選病毒。其中，與Burdock mottle virus同源的contigs數(shù)目最高為3，其次檢測到了與Choristoneura occidentalisgranulovirus和Beet soil-borne mosaic virus同源的contigs數(shù)都為2，樣本中還檢測到與Culex originated Tymoviridae-like virus、Fig fleck-associated virus、Beet necrotic yellow vein virus、Blackberry virus E、Grapevine fleck virus同源的contigs數(shù)都為1。由于檢測到的與8種病毒同源的contigs數(shù)目均較少，而且能比對上的contigs總長度都較短，因此測序結(jié)果需要進(jìn)一步的試驗驗證才能明確所采集的樣品里是否含有這幾種病毒。

表3 5個數(shù)據(jù)庫所注釋的contigs結(jié)果統(tǒng)計Tab.3 Contigs statistics annotated by 5 databases

表4 平菇siRNA文庫病毒檢測結(jié)果Tab.4 Detection results of virus in Pleurotus ostreatus siRNA library

2.5 RT-PCR驗證

根據(jù)序列拼接結(jié)果，設(shè)計針對這八種候選病毒的特異性引物，利用RT-PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增驗證，RT-PCR結(jié)果卻未檢測到目的條帶，說明采集的平菇樣品中不存在這八種病毒，推測平菇球形癥狀的產(chǎn)生可能不是由于病毒侵染所導(dǎo)致的。

3 討論

常規(guī)的檢測方法在病毒檢測和新病毒發(fā)現(xiàn)中存在一定缺陷，適用于研究比較清楚的病毒，其針對性強(qiáng)，但對于新病毒的發(fā)現(xiàn)較困難。與其相比，應(yīng)用深度測序技術(shù)可在病毒序列、特征等信息未知情況下，只需要提取樣品總RNA，通過篩選，建立小RNA文庫，然后對小RNA進(jìn)行測序，并通過組裝來檢測和發(fā)現(xiàn)病毒，靈敏度高，適用性強(qiáng)，獲得的信息豐富。近年來，利用siRNA深度測序技術(shù)已在鑒定許多動植物的未知病原物中發(fā)揮重要作用[15-18]。

目前，對食用菌病毒研究相對較少，可以利用的序列信息也較少，利用常規(guī)檢測方法難以對食用菌病毒做到全面檢測和鑒定，特別是尚未報道的病毒[19]。本研究利用siRNA高通量測序技術(shù)直接對球形平菇樣品中提取的siRNA進(jìn)行測序和生物信息學(xué)分析，鑒定其是否受病毒侵染，結(jié)果證明本研究采集的球形平菇樣品中不存在病毒，表明這種癥狀的產(chǎn)生并不是由病毒侵染所導(dǎo)致的。平菇畸形癥狀產(chǎn)生的原因有很多，包括栽培環(huán)境不適宜、管理不當(dāng)、菌種退化或變異等，我們所采集的樣品具體由哪種原因所導(dǎo)致還有待于進(jìn)一步的試驗證明。

[1]陳玉梅.平菇高產(chǎn)高效栽培[J].農(nóng)業(yè)知識：瓜果菜，2013（23）：46-47.

[2]李彥鵬，梁振普，張小霞，等.食用菌病毒研究進(jìn)展[J].中國農(nóng)學(xué)通報，2006，22（8）：408-413.

[3]Hollings M.Viruses associated with die-back disease of cultivated mushroom[J].Nature,1962,196(4858):962-965.

[4]劉宏迪，梁平彥.感染病毒的側(cè)耳的超微結(jié)構(gòu)[J].微生物學(xué)報，1986，26（3）：221-225.

[5]Schwartz EF,Stollar BD.Antibodies to polyadenylatepolyuridylate copolymers as reagents for double strand RNA and DNA-RNA hybrid complexes[J].Biochem and Biophys Res Commun,1969,35(1):115-120.

[6]張鶴齡，馬志亮.雙鏈核糖核酸免疫化學(xué)研究[J].真菌學(xué)報，1984，3（4）：233-238.

[7]Morris TJ,Dodds JA.Isolation and analysis of double-stranded RNA from virus infected plant and fungal tissue[J].Phytopathology,1979,69(8):854-858.

[8]周雪平，李德葆.雙鏈RNA技術(shù)在植物病毒中的應(yīng)用[J].生物技術(shù)，1995，5（1）：1-4.

[9]方詳，葉華智，曹燕.四川省稻瘟病菌中dsRNA因子的檢測[J].四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2000，18（4）：315-318.

[10]Shigeru K,Tsutomu F,Shen RL,et al.Double-stranded RNA virus in human pathogenmic fungus blastomyces dermatitidis[J].Journal of Virology,1994,68(11):7554-7558.[11]劉莉，陳集雙.利用TaqDNA聚合酶直接從雙鏈RNA模板中擴(kuò)增靶序列[J].微生物學(xué)通報，2007，34（1）：57-60.

[12]章松柏，吳祖建，段永平，等.一種實用的雙鏈RNA病毒基因克隆方法[J].長江大學(xué)學(xué)報：自然版，2005，25（1）：71-73.

[13]Hamilton AJ,Baulcombe DC.A species of small antisense RNA in posttranscriptional gene silencing in plants[J].Science,1999,286(5441):950-952.

[14]Blevins T,Rajeswaran R,Shibaprasad PV,et al.Four plant dicers mediate viral small RNA biogenesis and DNA virus induced silencing[J].Nucleic Acids Res,2006,34(21):6233-6246.

[15]Kreuze JF,Perez A,Untiveros M,et al.Complete viral genome sequence and discovery of novel viruses by deep sequencing of small RNAs:a generic method for diagnosis,discovery and sequencing of viruses[J].Virology,2009,388:1-7.

[16]Hagem C,Frizzi A,Kao J,et al.Using small RNA sequences to diagnose,sequence,and investigate the infectivity characteristics of vegetable-infecting viruses[J].Arch Virol,2011,156(7):1209-1216.

[17]Wu QF,Luo YJ,Lu R,et al.Virus discovery by deep sequencing and assembly of virus-derived small silencing RNAs[J].Proc Natl Acad Sci USA,2010,107(6):1606-1611.

[18]Giampetruzzi A,Roumi V,Roberto R,et al.A new grapevine virus discovered by deep sequencing of virus-and viroid-derived small RNAs in Cv pinot gris[J].Virus Res,2012,163(1):262-268.

[19]徐章逸，邊銀丙.食用菌病毒病害研究進(jìn)展[J].食用菌學(xué)報，2008，15（3）：80-84.