診斷超聲輻照對子代大鼠生長發(fā)育及腦組織超微結(jié)構(gòu)的影響

劉艷+周琳瑛+林曦

【摘要】 目的：探討孕期大鼠超聲輻照后對子代生長發(fā)育及大腦組織超微結(jié)構(gòu)的影響，從而進一步了解孕期超聲檢查的安全性。方法：以診斷劑量的超聲輻照對孕8 d SD大鼠分別在孕8 d（早期）、孕12 d（中期）及孕16 d（晚期）進行3次時長分別為0 min（無超聲輻照，正常對照組）、5、10及20 min的超聲輻照后觀察子代大鼠生長發(fā)育及其大腦組織超微結(jié)構(gòu)的變化。結(jié)果：超聲輻照20 min組子代大鼠P1、P3、P5、P7體重明顯低于對照組（0 min組），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05或P<0.01），首次睜眼時間亦明顯推遲，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），前臂懸掛時間也短，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。超聲輻照5 min組和10 min組與正常對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論：孕期大鼠在孕早中晚期分別進行一次超聲輻照，每次超聲輻照時長20 min，可影響子代大鼠生長發(fā)育并引起其大腦組織超微結(jié)構(gòu)發(fā)生病變。

【關(guān)鍵詞】 超聲輻照； 子代大鼠； 生長發(fā)育； 腦組織； 電鏡技術(shù)

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2017.35.030 文獻標(biāo)識碼 B 文章編號 1674-6805（2017）35-0061-03

隨著診斷超聲技術(shù)的不斷發(fā)展，其在產(chǎn)科應(yīng)用越來越廣泛，目前已成為發(fā)現(xiàn)胚胎異常及胎兒畸形首選的檢查手段。近年來，為了提高診斷準(zhǔn)確率，超聲儀器在裝備技術(shù)和軟件開發(fā)上日新月異，診斷超聲的頻率、輸出功率均有大幅提高，檢查時間也相應(yīng)增加，其潛在危險就隨之增加。因胎兒組織細胞較成人更易受超聲生物效應(yīng)作用，診斷超聲的生物效應(yīng)對胎兒各系統(tǒng)的安全性問題越來越受到國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注[1-2]。本實驗?zāi)康氖怯^察孕鼠早中晚期分別接受不同時長的超聲輻照后對子代大鼠生長發(fā)育和其大腦組織超微結(jié)構(gòu)的影響，為臨床醫(yī)師在產(chǎn)科超聲檢查中更好地選擇輻照時間提供資料。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選健康的孕8 d的SD孕鼠（350±21.3）g 16只。

1.2 實驗儀器

GE Voluson E8彩色多普勒超聲診斷儀，采用腹部探頭頻率為3～5 MHz。

1.3 方法

1.3.1 大鼠分組 孕8 d的SD孕鼠（350±21.3）g 16只隨機分為四組，每組4只：對照組即無診斷超聲輻照組（0 min組）；超聲5 min 3次組，即應(yīng)用診斷超聲劑量對孕鼠腹部照射5 min，每隔4 d一次，連續(xù)3次（5 min組）；超聲10 min 3次組，即應(yīng)用診斷超聲劑量對孕鼠腹部照射10 min，每隔4 d一次，連續(xù)3次（10 min組）；超聲20 min 3次組，即應(yīng)用診斷超聲劑量對孕鼠腹部照射20 min，每隔4 d一次，連續(xù)3次（20 min組）。

而后，各組大鼠正常生產(chǎn)的子代依據(jù)生殖器與肛門之間的距離判斷雌雄，近者為雌，遠者為雄。隨機取4只（雌雄各半），取腦組織進行電鏡觀察以對比各組孕鼠子代腦組織的超微病理變化。

剩余的各組孕鼠生產(chǎn)的子代大鼠隨機抽取20只（雌雄各半）進行生長發(fā)育的觀察，內(nèi)容包括出生7 d內(nèi)的體重變化、首次睜眼時間、雙上臂懸掛持續(xù)的時間。

1.3.2 體重測量 分別于出生即刻P1，出生后第3天P3，出生后第5天P5，出生后第7天P7時間段稱量子代大鼠體重，以克（g）為單位。

1.3.3 子代大鼠雙眼睜開時間記錄 記錄子代大鼠雙側(cè)眼睛初次睜開的日齡，以天（d）為單位。

1.3.4 子代大鼠上臂懸掛實驗 出生后2周P14子代大鼠雙前腳抓住一水平金屬棍（直徑大約0.5 cm），距離桌面30 cm高度，記錄子代大鼠雙前腳抓牢金屬棍后身體懸掛持續(xù)的時間，并以分鐘（min）為單位計數(shù)。

1.3.5 子代大鼠腦組織超微結(jié)構(gòu)觀察 大鼠乙醚吸入麻醉后固定，開顱取大鼠腦皮質(zhì)約（0.1×0.1×0.1）cm3大小的組織4小塊，經(jīng)3%戊二醛-1.5%多聚甲醛（PH=7.4）前固定，4 ℃過夜，磷酸緩沖液（pH=7.4）漂洗3次后1%鋨酸-亞鐵氰化鉀溶液后固定2 h（4 ℃），標(biāo)本經(jīng)50%、70%、90%、100%乙醇，100%丙酮逐級脫水，環(huán)氧樹脂Epon618浸透包埋，超薄切片經(jīng)硝酸鉛-醋酸鈾雙染后FEI Tecnai BioIWIN透射電鏡觀察。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用統(tǒng)計軟件SPSS 14.0統(tǒng)計包對數(shù)據(jù)進行分析，結(jié)果以（x±s）表示，采用one-way ANOVA（完全隨機設(shè)計的單因素方差分析）進行統(tǒng)計學(xué)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 孕鼠接受不同時長超聲輻照對子代大鼠生長發(fā)育的影響

2.1.1 不同時長超聲輻照對子代大鼠出生后1周內(nèi)體重的影響 0 min組、5 min組、10 min組、20 min組子代大鼠不同日齡體重的變化見圖1。超聲輻照5 min組和0 min組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），超聲輻照10 min組子代大鼠雖然P1、P3、P5、P7體重均低于0 min組，但是差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），而超聲輻照20 min組P1、P3、P5、P7各日齡體重明顯低于0 min組，各日齡段，兩組的比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）。

2.1.2 不同時長超聲輻照后子代大鼠首次睜眼時間比較 各組子代大鼠首次睜眼時間比較見表2。超聲輻照5 min組、10 min組子代大鼠睜眼時間與0 min組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），而超聲輻照20 min組與0 min組比較，首次睜眼時間明顯推遲，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。

各組子代大鼠上臂懸掛時間比較見表1。5 min組和10 min組子代大鼠上臂懸掛時間與0 min組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），而20 min組與0 min組比較，上臂懸掛時間短，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。endprint

2.2 不同時長超聲輻照對子代大鼠腦組織超微結(jié)構(gòu)的影響

對0 min組、5 min組、10 min組子代大鼠的腦組織進行電鏡觀察，神經(jīng)細胞結(jié)構(gòu)完整，細胞核及細胞質(zhì)內(nèi)線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基復(fù)合體等細胞器未見異常，神經(jīng)細胞突起無水腫等變化（圖2）。20 min組子代大鼠腦組織電鏡觀察可見部分神經(jīng)細胞內(nèi)線粒體腫脹，線粒體嵴稀疏斷裂（圖3），部分神經(jīng)細胞內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度擴張，核周隙亦腫脹（圖3）。

3 討論

超聲生物效應(yīng)是指一定強度的超聲波（由輻照聲強和輻照時間兩個因素決定）在生物體系內(nèi)傳播時，通過它們之間一定的相互作用機制（熱生物效應(yīng)、機械生物效應(yīng)）致使生物體系的功能和結(jié)構(gòu)發(fā)生變化[3]。

近年來，許多動物實驗表明高功率或者長時間超聲輻照會引起絨毛細胞腫脹甚至凋亡，子代體重減輕，胎兒角膜上皮腫脹，子代的生殖細胞線粒體腫脹等變化[4]。Ang等[5]研究發(fā)現(xiàn)孕期超聲輻照30 min或以上的子鼠大腦皮質(zhì)細胞有一部分未能移行到大腦皮質(zhì)相應(yīng)位置，這種異常分布的皮質(zhì)細胞數(shù)量與超聲輻照時間成正相關(guān)；王勇等[6]研究發(fā)現(xiàn)孕期超聲20 min重復(fù)輻照可能對子鼠出生后的行為發(fā)育產(chǎn)生影響；栗建輝等[7]的研究則發(fā)現(xiàn)實時三維超聲輻照孕晚期大鼠發(fā)現(xiàn)10 min后即可見部分細胞凋亡。

二維彩色多普勒超聲的輸出功率雖然比實時三維超聲低，但孕期常需多次超聲檢查，因而輻照的次數(shù)也比較多。本實驗?zāi)M臨床孕婦的超聲檢查，在大鼠孕早期、中期、晚期分別予以診斷劑量超聲輻照，觀察不同輻照時長對子代大鼠的影響，發(fā)現(xiàn)超聲輻照5 min及10 min組，子代大鼠出生時體重、首次睜眼時間及前臂懸掛能力與正常對照組相（0 min組）比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），腦組織電鏡檢查也未發(fā)現(xiàn)異常，這與目前文獻[8-9]的研究結(jié)果一致。超聲輻照20 min組子代大鼠出生1周內(nèi)體重均比對照組輕，睜眼時間推遲，出生后2周，前臂懸吊能力弱于正常組，兩組相比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。腦組織電鏡檢查發(fā)現(xiàn)部分神經(jīng)細胞線粒體腫脹，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)亦可見擴張，核周隙腫脹。這些實驗結(jié)果與文獻[10]研究結(jié)果類似。引起這些異常的原因還不確切，可能與直接的超聲輻照所產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)有關(guān)，也可能是超聲輻照后引起胎盤絨毛細胞損傷而引起胚胎營養(yǎng)供應(yīng)不良有關(guān)。線粒體是細胞產(chǎn)生ATP的場所，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細胞合成蛋白質(zhì)的重要細胞器[11]，二者的損傷容易導(dǎo)致神經(jīng)細胞功能受到影響。有報道探頭頻率為7.5 MHz的經(jīng)陰道超聲持續(xù)照射孕囊10 min可致絨毛細胞損傷，但是這些損傷是可逆的，超聲輻照后24 h損傷最明顯，而7 d后，絨毛細胞逐漸恢復(fù)正常[12]。所以本實驗觀察到的這些損傷是否可逆，則有待于對子代大鼠進行更進一步的中長期觀察。

綜上所述，孕鼠早、中、晚孕期接受診斷劑量超聲輻照5 min及10 min對子代大鼠生長發(fā)育及大腦組織結(jié)構(gòu)無明顯影響，而20 min后子代大鼠生長發(fā)育及神經(jīng)細胞超微結(jié)構(gòu)均有受損。ALUM提出了ALARA原則，即產(chǎn)科檢查時，在保證能獲得必要的超聲診斷信息的前提下，用盡可能小的超聲輸出功率，在盡可能短的時間（建議<20 min）內(nèi)完成檢查[13]。

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（收稿日期：2017-08-03）endprint