副豬嗜血桿菌的藥敏試驗(yàn)

王圣花（山東省陽谷縣畜牧局 252300）

副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis, HP)，屬革蘭氏陰性短小桿菌，形態(tài)多種多樣，副豬嗜血桿菌易感染斷奶后和保育階段的5～8周的幼豬，發(fā)病率一般在10%～15%，嚴(yán)重時(shí)死亡率可達(dá)50%[1]。由于當(dāng)今科技飛速發(fā)展以及社會不斷進(jìn)步，大規(guī)模養(yǎng)豬業(yè)得到了空前的發(fā)展，副豬嗜血桿菌感染也隨之成為影響?zhàn)B豬業(yè)的嚴(yán)重性疾病。該細(xì)菌在環(huán)境中普遍存在，流行于我國各地，使養(yǎng)豬業(yè)損失嚴(yán)重，因此該病菌感染成為危害養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的呼吸系統(tǒng)性疾病之一[2]。加之規(guī)?；曫B(yǎng)技術(shù)的不成熟和飼養(yǎng)密度過高，以及呼吸道病并發(fā)等因素的存在，使得該病日趨流行，危害日漸嚴(yán)重。本實(shí)驗(yàn)通過對該病原體進(jìn)行鑒定以及多種藥物的敏感試驗(yàn)，結(jié)果表明，治療豬副嗜血桿菌病最有效的藥物是頭孢類抗生素，說明藥敏測試在指導(dǎo)臨床治療中具有重要的意義。

豬副嗜血桿菌病是豬場內(nèi)常見的由副豬嗜血桿菌引起的一種嚴(yán)重的接觸性傳染性疾病之一，近幾年，在我國多個(gè)地區(qū)此病大肆流行，因此有必要對該細(xì)菌進(jìn)行藥物敏感性研究，該實(shí)驗(yàn)在指導(dǎo)臨床治療選擇抗感染藥物時(shí)具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)儀器 手提式、電泳儀、PCR儀、低溫冰箱、低溫離心機(jī)、凝膠成像儀、CO2培養(yǎng)箱、TD-20/20型熒光光度計(jì)、純水儀、SHP-250生化培養(yǎng)箱、超凈工作臺。

1.1.2 主要培養(yǎng)基及試劑 鮮血培養(yǎng)基、普通平板培養(yǎng)基、含NAD因子培養(yǎng)基以及巧克力培養(yǎng)基，TSB來自O(shè)xioid公司，TSA來自Difco公司。

1.1.3 藥品 18種抗生素，分別為四環(huán)素、沃尼妙林、泰妙菌素、泰樂菌素、新霉素、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、林可霉素、替米考星、氟苯尼考、頭孢他啶、大觀霉素、氨芐西林、青霉素、頭孢噻肟、頭孢噻呋鈉、恩諾沙星、氧氟沙星。

1.2 抑菌圈測量和參考標(biāo)準(zhǔn)

本試驗(yàn)將選定的3株副豬嗜血桿菌，HPS-0，HPS-1和HPS-2分別接種于含NAD因子的TSA培養(yǎng)基上，均勻涂布，晾干，用高壓滅菌后的鑷子將18種抗生素的藥敏紙片按一定的距離分別貼于培養(yǎng)基表面，37℃條件的 CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，通過卡尺測定抑菌圈的直徑，通過直徑大小判斷藥物的敏感性[5]。參考一般性細(xì)菌敏感試驗(yàn)的判定標(biāo)準(zhǔn)，本實(shí)驗(yàn)設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)為：抑菌圈直徑＜10mm，為不敏感，標(biāo)記為—；抑菌圈直徑≥10mm，且＜20mm，為敏感，標(biāo)記為+；抑菌圈直徑≥20mm，且＜30mm，為高度敏感，標(biāo)記為++；抑菌圈直徑≥30mm為極敏感，標(biāo)記為+++。

2 結(jié)果

3株副豬嗜血桿菌對18種抗生素的敏感性測試結(jié)果如以下表1所示。總體上看，副豬嗜血桿菌對頭孢菌素類抗生素最為敏感，副豬嗜血桿菌對剩余其他大部分抗生素產(chǎn)生嚴(yán)重的耐藥現(xiàn)象。單個(gè)細(xì)菌來說，HPS-2最為敏感。

表1 HPS-0、HPS-1和HPS-2藥敏試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

3.1 細(xì)菌的鑒定與培養(yǎng)

副豬嗜血桿菌是一種不運(yùn)動、非溶血性的革蘭氏陰性桿菌，形態(tài)多種多樣，細(xì)長的絲狀菌體、單個(gè)球桿菌，無芽孢和鞭毛，屬于兼性厭氧菌。副豬嗜血桿菌在普通培養(yǎng)基中不生長，在胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基(TSA)、巧克力瓊脂平板、胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB)液體培養(yǎng)基中生長時(shí)嚴(yán)格需要煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，副豬嗜血桿菌和金黃色葡萄球菌共同接種于鮮血瓊脂平板上，在37℃條件下培養(yǎng)24～48h，會呈現(xiàn)典型的“衛(wèi)星生長”現(xiàn)象，并且不出現(xiàn)溶血現(xiàn)象。副豬嗜血桿菌的鑒定方法一般采用糖發(fā)酵試驗(yàn)，半乳糖發(fā)酵、葡萄糖發(fā)酵、麥芽糖發(fā)酵結(jié)果通常均為陽性。若采用某些生化鑒定方法，副豬嗜血桿菌一般不夠敏感，甚至某些反應(yīng)不夠穩(wěn)定，常見的酶類，比如磷酸酶和接觸酶為陽性結(jié)果，烏苷酸酶、氧化酶為陰性結(jié)果[3]。

3.2 血清分型與毒力研究

瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)和熱穩(wěn)定性可溶性抗原試驗(yàn)是常見的血清學(xué)分型方法，到目前為止，副豬嗜血桿菌有15個(gè)血清型以上，血清型5、4、13最為常見，不同的血清型其毒力強(qiáng)度不同，強(qiáng)毒株包括1、5、10、12、13、14六個(gè)血清型，具有高致病性，動物感染后，可以引起動物死亡[4]。中等毒力株包括2、4、8和15四個(gè)血清型，豬感染以后，可以引起漿膜炎，但這種疾病不會引起豬的死亡。另外，豬感染3、6、7、9和11五個(gè)血清型后，不會引起病理損傷以及明顯的臨床癥狀。影響副豬嗜血桿菌毒力的因素包括多個(gè)方面，其中，莢膜、脂多糖以及菌毛的相關(guān)報(bào)道最多。莢膜的主要成分是多糖和磷壁酸，有文獻(xiàn)報(bào)道，從病豬上呼吸道分離得到的副豬嗜血桿菌大多具有莢膜結(jié)構(gòu)，而從肺部或其它組織中提取的菌體大多數(shù)不具有莢膜結(jié)構(gòu)。脂多糖(lipopolysacchride，LPS)是一種細(xì)菌菌體外表抗原，通過比較強(qiáng)毒力菌株和無毒力菌株的脂多糖，發(fā)現(xiàn)源自這兩種不同菌株的脂多糖無差異，有文獻(xiàn)報(bào)道了副豬嗜血桿菌合成的脂多糖結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)毒力菌株與無毒力菌株的脂多糖成分相似，通過實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)菌毛與毒力關(guān)系也不成正相關(guān)，因此三者與毒力的關(guān)系還需實(shí)驗(yàn)研究來進(jìn)一步確定。

3.3 靈活使用敏感藥物

頭孢類抗生素是治療副豬嗜血桿菌最為有效的藥物，但是，由于副豬嗜血桿菌血清型比較復(fù)雜，因此，針對不同地區(qū)的豬場，治療副豬嗜血桿菌病的感染時(shí)，應(yīng)根據(jù)當(dāng)?shù)夭〉木唧w情況治療，切記效仿用藥。畜主應(yīng)該及時(shí)聯(lián)系當(dāng)?shù)匦竽敛块T，進(jìn)行具體的試驗(yàn)測試、病原體分離鑒定和藥物敏感測試，可以結(jié)合當(dāng)?shù)氐闹委熃?jīng)驗(yàn)，選擇合適的藥物進(jìn)行治療。一旦發(fā)現(xiàn)有可疑病豬時(shí)，可以同時(shí)采用注射和口服兩種給藥方式，以免由于一種給藥方式起效較慢而延誤最佳的治療時(shí)間。

[1] Alex, Joaquim Segale, Virginia. Update on the diagnosis of Haemophilus parasuis infection in pigs and novel genotyping methods[J].The Veterinary Journal. 2007, 174: 522-529.

[2] 王翔, 莊艷. 豬副豬嗜血桿菌病的診斷及其綜合防治[J]. 中國畜禽種業(yè). 2010, 1: 67.

[3] Smart NL, Miniats O P. Mactnnes J I. Analysis of Haemophilus parasuis isolates from southern Ontario swine by restriction endonuclease fingerprinting[J]. Can J Vet Res. 1988, 52: 319-324.

[4] 汪聯(lián), 毛世香, 丁玉春等. 副豬嗜血桿菌的分型與毒力因子研究[J]. 獸醫(yī)研究. 2010, 255: 54-56.

[5] 周斌, 儲岳峰, 李超等. 華東地區(qū)副豬嗜血桿菌的分離、血清型鑒定與藥敏分析[J]. Animal Husbandry & Veterinary Medicine. 2009,141(111): 84-86.