櫻桃谷鴨I亞群腺病毒PCR方法的鑒定

劉新勃（山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院 山東 濰坊 261061）孫 嘉 吳少鵬 鞠孜敬（山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 山東 泰安）唐德宏（山東省泰安市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心）

禽腺病毒(Fowl adenovirus，F(xiàn)AdV)是全世界家禽和野禽常見的具有傳染性的病原。許多腺病毒可在健康禽類體內(nèi)復(fù)制，卻不表現(xiàn)感染癥狀或只是引起輕微的病癥，但發(fā)生混合感染或其它一些因素影響時(shí)，也會(huì)表現(xiàn)出較嚴(yán)重的發(fā)病癥狀，甚至引起死亡。禽腺病毒屬中的一類毒株本身就具有較強(qiáng)的致病性，如火雞出血性腸炎病毒(Hemorrhagic enteritis virus, HEV)、產(chǎn)蛋下降綜合征病毒(Egg drop syndrome virus, EDSV)等，這些病毒本身就是原發(fā)病原[1]。根據(jù)禽腺病毒抗原性的差異，將其分為三個(gè)群：I亞群FAdV具有共同的群抗原，根據(jù)中和試驗(yàn)可將其分為12個(gè)血清型，Zsak等利用RFLP技術(shù)又將I亞群FAdV劃分為A-E 5個(gè)基因型。I亞群FAdV呈世界性分布，各年齡段家禽均易感。臨床上，病毒在鴨、鵝、雞體內(nèi)普遍存在，可引起包涵體肝炎、心包積液、肌胃糜爛等病變，且能垂直傳播，污染雞胚[2]。大多數(shù)I亞群FAdV的致病作用還位完全確定，但FAdV-1株能引起鵪鶉支氣管炎，F(xiàn)AdV-4株是心包積水綜合征的主要原因。Ⅱ、Ⅲ亞群腺病毒主要包括HEV和EDSV[3-5]等。目前，EDSV被定義為鴨腺病毒1型(Duck adenovirus 1, DAdV 1），對(duì)產(chǎn)蛋期成年家禽的產(chǎn)蛋率有較大影響。1982年從一只番鴨體內(nèi)分離得到一株I亞群腺病毒，該毒株與雞和火雞體內(nèi)分離到的毒株差異較大，被歸為鴨腺病毒2型(Duck adenovirus 1, DAdV 2)[6]。

FAdV分布廣泛，隨著家禽養(yǎng)殖業(yè)的不斷發(fā)展，家禽飼養(yǎng)基數(shù)的不斷增加，F(xiàn)AdV每年的感染數(shù)量都在增加，尤其是近兩年以包涵體肝炎和心包積液為特征的FAdV的發(fā)病情況日益嚴(yán)重[7,8]。PCR已被廣泛應(yīng)用于I亞群FAdV的檢測，用病毒六鄰體基因做引物可區(qū)分A-E種并定位病毒的種內(nèi)血清型。本研究為采用PCR檢測方法探究山東泰安地區(qū)鴨體內(nèi)I亞群FAdV的感染情況，這一探索將便于該病原的檢測和疾病的防控。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 樣品來自山東地區(qū)的病死櫻桃谷鴨肝臟、脾臟共計(jì)54份，櫻桃谷肉種鴨場的死胚48份。

1.1.2 主要試劑 Tris 平衡酚購自Solarbio，瓊脂粉購自Biowest，2×Taq Master Mix（含Taq DNA Polymerase，dNTP，優(yōu)化的緩沖體系）購自諾唯贊生物科技有限公司，pUMD19-T載體購自Thermo Fisher Scientific，Trans 5α感受態(tài)細(xì)胞購自Takara，其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 引物信息 根據(jù)已發(fā)表的I亞群FAdV基因序列及文獻(xiàn)報(bào)道，選取兩對(duì)引物，由上海生工生物工程有限公司合成。FAdV-H1：5’-TGGACATGGGGGCGACCTA-3’；5’-AAGGGATTGACGTTGTCCA-3’，預(yù)計(jì)擴(kuò)增目的片段長度為1200bp。FAV-H2：5’-AACGTCAATCCCTTCAAC CACC-3’；5’-TTGCCTGTGGCGAAAGGCG-3’，預(yù)計(jì)擴(kuò)增目的片段長度為1300 bp。

1.2.2 病鴨剖檢 對(duì)臨床表現(xiàn)出明顯發(fā)病癥狀的肉鴨進(jìn)行臨床剖檢。

1.2.3 病毒基因組DNA提取 采用傳統(tǒng)苯酚氯仿法提取I亞群FAdV的基因組DNA。

1.2.4 PCR體系及條件 PCR反應(yīng)體系為25μl，2×Taq Master Mix 12.5μl，上下游引物各0.5μl，ddH2O 10.5μl。PCR反應(yīng)程序?yàn)?5℃預(yù)變性5min；94℃變性45s，56℃退火45s，72℃延伸1min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。

1.2.5 PCR產(chǎn)物的鑒定 取7μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的大小進(jìn)行初步鑒定，瓊脂糖凝膠濃度為1%。利用凝膠回收試劑盒回收與目的片段大小相符的特異性片段，將基因片段連接至pUMD19-T載體，連接體系為：T4 DNA Ligase 1μl，pUMD19-T Simple Vector 1μl，10×Ligase Buffer 1μl，回收的PCR產(chǎn)物7μl。16℃過夜連接后轉(zhuǎn)化入Trans 5α感受態(tài)細(xì)胞。挑取單個(gè)轉(zhuǎn)化菌落于LB培養(yǎng)液(Amp+)過夜培養(yǎng)，PCR鑒定陽性克隆送至鉑尚生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。

1.2.6 I亞群FAdV部分核苷酸序列分析 將測得的基因片段序列與I亞群FAdV參考株基因組序列比對(duì)，進(jìn)行同源性比較和基因進(jìn)化樹分析。用于核酸序列分析所用的I亞群FAdV各毒株名稱、血清型、GenBank登錄號(hào)、登錄時(shí)間、分離地區(qū)見附表。

附表I 亞群FAdV參考株信息

2 結(jié)果與分析

2.1 剖檢結(jié)果

心臟膨大疲軟，心肌內(nèi)外膜出血，有心包積液；肝臟腫大，質(zhì)脆；肺部壞死，表面附有膠凍樣物質(zhì)；膽部腫大，呈墨綠色；胰腺出血；腺胃膜容易脫落；脾臟呈暗紅色，腫大，表面有針尖大小的白色壞死點(diǎn)；腸道有出血；腎部表面有尿酸鹽沉積(圖1)。

圖1 眼觀病變

2.2 PCR檢測結(jié)果

提取病毒DNA，PCR擴(kuò)增后經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，在紫外凝膠成像儀下可觀察到，F(xiàn)AdV-H1引物擴(kuò)增出約1200bp左右的條帶，F(xiàn)AdV-H2引物條帶大小約為1300bp左右(圖2)。PCR檢測結(jié)果顯示，病料中I亞群FAdV陽性率為9.3%(5/54)，未從鴨死胚中檢測出I亞群FAdV感染。

2.3 I亞群FAdV部分基因序列同源性分析

隨機(jī)選擇PCR陽性樣品進(jìn)行克隆測序。序列分析發(fā)現(xiàn)，檢測到的FAdV片段和血清4型、血清10型有較高的同源性，與兩株在中國分離到的血清4型I亞群FAdV參考株(KU569296、KU981115)的同源性最高為97.7%。FAdV的部分基因片段與其它血清型的I亞群FAdV同源性較低(圖3)。由此可見，該FAdV毒株為血清4型I亞群FAdV。

圖2 部分送檢樣品中I亞群FAdV的PCR檢測結(jié)果

圖3 I亞群FAdV部分基因片段同源性分析圖

2.4 I亞群FAdV部分基因片段系統(tǒng)基因進(jìn)化樹

基因進(jìn)化樹顯示，檢測到的FAdV與兩株中國的血清4型I亞群FAdV參考株(KU569296、KU981115)位于基因進(jìn)化樹同一分支上，與印度的血清4型I亞群FAdV位于同一次級(jí)分支上，親緣關(guān)系較近(圖4)。

圖4 I亞群FAdV系統(tǒng)進(jìn)化樹

3 討論

3.1 I亞群FAdV的控制

I亞群FAdV具有較強(qiáng)的抵抗力，通過嚴(yán)格的消毒能夠消滅環(huán)境可控密閉雞舍內(nèi)的I亞群FAdV，由于I亞群FAdV可以通過種蛋垂直傳播，消除商品雞群中腺病毒存在很大困難，并且，從SPF雞獲得的經(jīng)驗(yàn)表明，病毒水平傳播的方式也是制約商品雞群控制I亞群FAdV感染的一大問題[9]，所以，控制原種雞的腺病毒感染是實(shí)際可行的方法。

3.2 FAdV發(fā)病癥狀和病變

（1）I亞群FAdV發(fā)病除引起包涵體肝炎、心包積水綜合征、肌胃糜爛等典型癥狀外，還對(duì)產(chǎn)蛋量、飼料轉(zhuǎn)化率和生長有一定影響，并且可能與呼吸道癥狀和腱鞘炎的發(fā)生有很大關(guān)聯(lián)。一些學(xué)者報(bào)道，某些I亞群FAdV毒株感染可使產(chǎn)蛋降低10%或者影響蛋殼質(zhì)量。國內(nèi)外已有一些關(guān)于I亞群FAdV感染導(dǎo)致飼料轉(zhuǎn)化率降低的報(bào)道，研究發(fā)現(xiàn)，將自然感染的家禽在實(shí)驗(yàn)室條件下飼養(yǎng)會(huì)出現(xiàn)生長遲緩的現(xiàn)象[10,11]。家禽發(fā)生呼吸道疾病時(shí)，經(jīng)?？蓮暮粑乐蟹蛛x到I亞群FAdV，從發(fā)生腱鞘炎家禽的病變部位也分離到I亞群FAdV，呼吸道疾病和腱鞘炎的發(fā)生可能與I亞群FAdV有關(guān)。（2）在包涵體肝炎病例中，肝臟蒼白、質(zhì)脆、腫脹，肝臟和骨骼肌有出血點(diǎn)和出血斑，肝臟細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)包涵體為主要的病理變化。在心包積水綜合征病例中，心包腔中有淡黃色清亮積液，肺水腫，肝臟腫脹和變色，腎腫脹并伴有腎小管擴(kuò)張，心臟和肝臟出現(xiàn)多發(fā)性局灶性壞死灶。本研究在進(jìn)行臨床剖檢時(shí)，發(fā)現(xiàn)心包積液為主要的眼觀病變，其它病變并不明顯。

3.3 PCR對(duì)FAdV的檢測

（1）PCR方法準(zhǔn)確，靈敏，具有很好的特異性。目前對(duì)I亞群FAdV的檢測主要采用PCR、ELISA實(shí)驗(yàn)[12-15]，對(duì)于有血凝性的病毒如EDSV通過HA/HI試驗(yàn)檢測，但敏感性不高，我們采用PCR方法從鴨群中分離I亞群FAdV，結(jié)果證明I亞群FAdV在泰安地區(qū)鴨群有流行，但是大群健康鴨帶毒不發(fā)病。（2）本研究對(duì)2017年自泰安地區(qū)采集的病死鴨病料進(jìn)行FAdV的分離鑒定，同時(shí)也根據(jù)剖檢癥狀檢測了其它常見具有傳染性的病原體，包括H5、H7和H9亞型禽流感病毒(Avian influenza virus, AIV)、鴨圓環(huán)病毒(Duck circovirus, DuCV)等，其它病原有陽性結(jié)果，但未檢測到I亞群FAdV與其它病毒同時(shí)感染的情況。另外，我們對(duì)PCR擴(kuò)增的片段測序后進(jìn)行序列比對(duì)和同源性分析發(fā)現(xiàn)，檢測到的FAdV主要為血清4型，也檢測到1例血清8b型，確定了用于PCR擴(kuò)增的引物的準(zhǔn)確性和特異性。

3.4 FAdV的流行及防治

有研究對(duì)I亞群FAdV進(jìn)行了流行病學(xué)調(diào)查，發(fā)現(xiàn)近幾年FAdV-2，F(xiàn)AdV-8，F(xiàn)AdV-10，F(xiàn)AdV-12四個(gè)血清型為優(yōu)勢血清型，選擇這四個(gè)優(yōu)勢血清型的毒株制成多價(jià)油乳滅活苗，疫苗免疫5日齡白羽肉雞后能誘導(dǎo)較高的抗體水平產(chǎn)生，在肉雞的生長期內(nèi)可抵抗I亞群FAdV的攻擊[15]。在國內(nèi)，I亞群FAdV還沒有商品化的疫苗用于臨床，使用感染禽的肝臟制成組織滅活苗對(duì)種雞進(jìn)行免疫，使后代獲得了較高水平的母源抗體，對(duì)雛雞抵抗I亞群FAdV的感染起了很好的預(yù)防作用。應(yīng)用本土分離株經(jīng)病毒擴(kuò)大培養(yǎng)，或利用感染禽的肝臟制成油乳劑滅活疫苗，免疫肉雞后能增強(qiáng)機(jī)體體液免疫和細(xì)胞免疫，對(duì)種雞進(jìn)行免疫后，能增強(qiáng)后代雛雞的母源抗體水平，對(duì)血清型復(fù)雜的I亞群FAdV的防控具有十分重要的意義。

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