放射性心臟損傷動物實驗研究進展

顧靜，吳紅彥，張雪燕，劉潤，李海龍，郭超

(甘肅中醫(yī)藥大學(xué), 蘭州 730000)

在進行胸腹部腫瘤如：乳腺癌、肺癌、霍奇金病、食管癌、賁門癌、胸腺瘤等惡性腫瘤的放射治療時，位于縱隔的心臟不可避免受到照射而引起的心臟損傷，統(tǒng)稱為放射性心臟損傷(radiation-induced heart damage，RIHD)[1]。以往認為心臟是對射線不敏感的器官，但隨著胸部腫瘤放療的廣泛應(yīng)用，放射性心臟損傷發(fā)生率已達20% ～68%[2]，是嚴重的放療副反應(yīng)。 2015年，Cella L在《Radiother Oncol》發(fā)表的研究中指出“胸腹部放療引起的放射性心臟損傷已經(jīng)與傳統(tǒng)的放射性肺纖維化損傷同等重要”[3]。

研究認為射線電離組織產(chǎn)生活性氧自由基，氧化應(yīng)激引起心臟局部產(chǎn)生無菌性炎癥反應(yīng)[4]，RIHD被初步認為是一個不斷漸進的炎性反應(yīng)和纖維化綜合作用的病理發(fā)展過程[5]。然而該病病因機制不明確，缺乏有效干預(yù)措施，本文就RIHD在動物實驗方面的研究結(jié)果進行綜述。

1 RIHD動物造模

1.1 造模動物種類

用于RIHD研究的模型動物常見的有大鼠[6-7]、小鼠[8-9]、犬[10-11]、兔[12]等。PET/CT心肌代謝顯像發(fā)現(xiàn)20Gy單次照射比格犬心肌前壁后[10-11]，照射區(qū)與非照射區(qū)存在病理差異，核磁掃描圖像分析也有一致結(jié)果，提示造模成功[10-11]。15Gy和20 Gy X線照射SD大鼠心臟，病理發(fā)現(xiàn)心肌細胞排列紊亂，出現(xiàn)變性及壞死,核排列不規(guī)則，膠原增多，纖維化明顯[6]。新西蘭兔分別接收多劑量(10，14，18，22，30，40，54 Gy)單次照射后4個月病理學(xué)檢查認為兔可作為RIHD模型動物[12]。病理學(xué)檢查還提示C57BL/6小鼠經(jīng)18 Gy和25 Gy照射后，心臟早期以急性炎癥改變?yōu)橹?后期以進行性纖維化為特征[8]。還有學(xué)者在實驗中讓雄性恒河猴接受單次全身輻射(6.5-8.4Gy)，恒河猴心肌纖維化發(fā)生率增高、左室內(nèi)徑減少、全身炎癥反應(yīng)升高[13]?？梢姺派湫孕呐K損傷可發(fā)生于多種動物，射線對心臟的損傷是明確且普遍的。

RIHD基礎(chǔ)實驗建模在動物選擇上，應(yīng)首先考慮動物心臟的解剖結(jié)構(gòu)、病理生理功能變化是否盡可能接近臨床放療后病人的心臟變化，從這點來說犬和豬等大型動物應(yīng)該是比較理想的造模對象，但一方面，考慮到實驗動物應(yīng)該經(jīng)濟、便于繁殖、飼養(yǎng)和取才方便的特點；另一方面，動物實驗學(xué)中通常多認為大鼠適合心肌病研究，該模型組織病理改變包括心肌退行性變化和纖維化，這符合放射性心臟損傷的炎性——纖維化病理改變特點，因此開展RIHD動物實驗建議首選大鼠為造模對象。

1.2 造模方法

就照射源來說，國內(nèi)外曾用60Co γ射線照射動物，而現(xiàn)在多用醫(yī)用直線加速器進行X線照射，其優(yōu)點是照射野劑量較均勻，對心臟組織損傷較小，適合大鼠和小鼠等小動物心臟照射。

就照射次數(shù)來說，包括單次照射造模和多次照射造模，絕大多數(shù)研究選用的造模方法為單次照射，而多次照射造模的研究較少。據(jù)分析認為，多次小劑量照射造模雖然符合臨床患者長時間、反復(fù)照射的放療實際，但在基礎(chǔ)研究中多次照射在動物實驗實施中困難較大。一方面，固定一致的胸前壁照射部位確定難度大，不便把控，這可能造成較大的實驗誤差，降低實驗數(shù)據(jù)的準確性和實驗的可行性；另一方面，放射性損傷有顯著的遲發(fā)效應(yīng)，單次照射后的損傷能較長時間影響心臟，促使其發(fā)生漸進性炎性——纖維化病理改變，鑒于這樣的病理變化特點，有理由認為單次大劑量照射可以滿足實驗研究的目的和要求，且單次照射在大規(guī)模動物試驗中簡單易行，節(jié)省人力、物力、財力，是多數(shù)RIHD基礎(chǔ)研究者的首選造模方法。

1.3 造模劑量

國內(nèi)外RIHD研究中，動物造模劑量變化較大，有報道10 Gy[13]以內(nèi)的，但大多數(shù)都在10 Gy以上，以15 Gy[6,14]、18 Gy[8,12,15-16]、20 Gy[6,10-11,14,17-21]、25 Gy[8,14]、30 Gy[12,22-23]照射劑量造模的研究較多，尤以20 Gy為最常見造模劑量。

經(jīng)匯總分析發(fā)現(xiàn)動物照射劑量差別較大，與照射方式有關(guān)：全身性照射時多組織器官均受到射線的損傷，動物不能耐受而大量死亡，故造模照射劑量較??；而“確定動物心前照射靶區(qū)[11-12]”、“動物體表應(yīng)用鉛板防護”、“照射儀器自帶銅管局限照射野”等防護措施使得動物只進行心前區(qū)心臟局部照射時，動物全身受射線影響較小，能夠耐受較大的照射劑量。相比于其他臟器，心臟是射線不敏感器官，因此對比全身性大面積小劑量照射，這種增加防護措施大劑量心臟局部照射對心臟的損傷更加顯著，更適合于動物放射性心臟損傷研究中的模型構(gòu)建。

1.4 造模指標及檢測方法

研究顯示造模指標包括：①心肌代謝顯像[10]；②病理HE染色觀察[6-8,10,12-14,16,19-20,24-25]和Masson染色計算膠原纖維容積比[6,13,14,16,20,24-25]；③動物超聲心動圖檢測射血分數(shù)(EF)[13,16]；④核磁檢測EF、左心室舒張期容積(EDV)、左心室收縮期容積(ESV)[11]等心功能指標；⑤ELISA心肌酶檢測血清肌鈣蛋白I(c Tn I)[8,13,17-18]、肌酸激酶同工酶(CK-MB)[17,21]、內(nèi)皮素1(ET-1)[18]、超氧化物歧化酶(SOD)[25]和丙二醛(MDA)[25]活性等；⑥免疫組化檢測核因子-κB(NF-κB)[6,19]⑦PCR檢測TGF-β1[14,17,24]、腫瘤壞死因子α(TNF-α)[22]、IL-10[23]、 IL-1[24]、血管緊張素Ⅱ1型受體(AT1)[16]、NF-κB[16,20]、 Bax[26]、細胞色素C(Cyt-C)[26]、BH3結(jié)構(gòu)域凋亡誘導(dǎo)蛋白截斷體(t-Bid)[26]、低氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)[20]、結(jié)締組織生長因子(CTGF)[14,20]、Ⅰ型膠原(COL-1)[20]等；⑧蛋白免疫印跡檢測IL-10[23]、AT1[16]、NF-κB[16,20]、Bax[26-27]、Bcl-2[27]、Cyt-C[26]、t-Bid[26]、HIF-1α[20]、CTGF[20]、COL-1[20]、p53[7]、過氧化物酶體增殖激活受體(PPAR)[9]、TGF-β1[9]和Smad3[14]等；⑨TUNNEL法檢測大鼠心肌細胞凋亡等[26]；⑩心電圖檢測心率和ST段[14]。此外，還有電鏡檢測線粒體[14]等方法應(yīng)用于RIHD的動物實驗中。

綜上所述，RIHD基礎(chǔ)實驗的實驗技術(shù)和檢測手段只停留在幾種常規(guī)的實驗方法上，最常用的實驗方法包括：病理HE 染色和Masson染色，免疫組化、PCR和蛋白免疫印跡等。最常用的檢測指標是組織病理觀察、心肌酶、炎性反應(yīng)和纖維化相關(guān)的細胞因子等。特別值得關(guān)注的是cTnI對心臟早期放射損傷有一定的診斷價值[18]。

2 機制研究

RIHD基礎(chǔ)實驗研究中，在機制探索方面涉及cTnI、NF-κB、TGF-β1、血管緊張素系統(tǒng)、過氧化物酶體增殖物活化受體PPAR-γ、內(nèi)皮素-1、p53、自噬、TNF-α、IL-1、IL-10等病理分子，但絕大多研究只有1-2篇相關(guān)文獻，研究不夠深入。

2.1 炎癥纖維化病變

根據(jù)上述檢測的病理性分子可以初步認為放射性心臟損傷機制，目前的研究主要集中在射線引起的炎癥反應(yīng)和纖維化病變方面。早期以急性炎癥為主，后期以進行性纖維化為特征；隨著受照劑量的增加，炎性反應(yīng)和纖維化程度加重，病變時間提前[8]。射線照射可啟動NF-κB炎癥反應(yīng)調(diào)控通路[9,20]，同時TNF-α[22]、IL-1[24]、IL-10[23]等炎性介質(zhì)高表達，引起心肌細胞水腫，炎癥細胞浸潤，隨后心肌纖維化改變，成纖維細胞增多，膠原纖維增多。纖維化病變可能與 TGF-β1[15,17-18]、 HIF-1α[20]、CTGF[20]、PPAR-r[9,15]在基因和蛋白水平表達上調(diào)有關(guān)。

RIHD的研究中報告TGF-β1高表達的文獻較多[9,15,17,24]，但都沒有深入探索TGF-β1信號通路的活化及調(diào)節(jié)在放射性心臟損傷中的作用機制。前期課題中我們曾以心臟纖維化的主要效應(yīng)細胞——心肌成纖維細胞作為研究對象觀察X線的促纖維化損傷效應(yīng)，也初步發(fā)現(xiàn)X線的這種損傷效應(yīng)與TGF-β1有密切關(guān)系，實驗中應(yīng)用PCR芯片技術(shù)觀察到X線誘導(dǎo)TGF-β1高表達的促纖維化效應(yīng)與Smad2、Smad3、Smad4、Smad7、MMP14、TIMP1等分子的異常表達有關(guān)[12]?？梢姡派湫孕呐K纖維化損傷是該放療副反應(yīng)有價值的研究方向，可能是未來用藥干預(yù)的靶點，值得進一步深入探索。

2.2 腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)

此外，血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)和醛固酮通過刺激血管收縮因子及其它生長因子的生成而起著先導(dǎo)炎性介質(zhì)的作用，血管緊張素Ⅱ和醛固酮可誘導(dǎo)細胞肥大、增殖或遷移、細胞外基質(zhì)增生。放射性心臟疾病的病理生理表現(xiàn)與上述血管緊張素-醛固酮引起的心血管病變是相似的，先是微血管損傷，接著是心肌缺血炎性反應(yīng)，最后是纖維化損傷。

2.3 氧化應(yīng)激

氧化應(yīng)激在RIHD的發(fā)生、發(fā)展中扮演重要角色[14,16,25]，直接證據(jù)是放射線照射早期引起線粒體腫脹，中后期出現(xiàn)線粒體嵴缺失，并呈現(xiàn)空化現(xiàn)象，甚至髓樣變，輻射直接損傷線粒體引起代謝異常、氧化應(yīng)激及DNA損傷[14]。

2.4 凋亡和自噬

X射線局部照射心臟引起RIHD早期出現(xiàn)心肌細胞凋亡，例如：隨著放射劑量的升高Bcl-2的表達降低，而Bax的表達升高[27]；另外，線粒體介導(dǎo)促凋亡蛋白Bax激活且發(fā)生轉(zhuǎn)位，Bax可能在t-Bid蛋白的協(xié)助下與線粒體膜融合形成特異性通道，介導(dǎo)Cyt-C的釋放[26]，引起心肌細胞凋亡的發(fā)生。

自噬也參與放射性心臟損傷，研究顯示X射線照射損傷大鼠心肌線粒體功能并誘導(dǎo)自噬發(fā)生，但自噬可能是心肌啟動自我保護的機制。關(guān)于自噬在RIHD中的意義有待進一步探討。

3 干預(yù)藥物

RIHD基礎(chǔ)實驗研究已經(jīng)開始藥物干預(yù)方面的探索，涉及的干預(yù)措施包括PPAR-γ激動劑吡格列酮、HMG-CoA還原酶選擇性抑制劑氟伐他汀和阿托伐他汀、重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1β、輔酶Q-(10)、曲美他嗪、血管緊張素Ⅱ1型受體拮抗劑氯沙坦、磷酸化的硫醇阿米非司汀、左旋肉堿等，中藥干預(yù)藥物有加味炙甘草湯、紅景天等。

總體來說藥物干預(yù)RIHD處于實驗嘗試階段，機制研究不全面不深入。相對于有限的中醫(yī)藥(加味炙甘草湯、紅景天)干預(yù)RIHD的動物實驗[27]來說，臨床運用中醫(yī)藥干預(yù)病患的研究較多。在中醫(yī)醫(yī)理中，放射性心臟損傷屬于“心悸”“胸痹”等范疇，主要是由于射線這種熱邪侵襲機體引發(fā)血瘀、氣滯等，造成痹阻胸陽，阻滯心脈，損傷氣血而致患者氣陰兩虛。臨床使用的中草藥及復(fù)方制劑，大多都體現(xiàn)出益氣養(yǎng)血、益氣活血或滋陰養(yǎng)血兼解毒的治則治法，中醫(yī)藥防護RIHD有極大的優(yōu)勢，但動物實驗開展不足，相關(guān)藥理和藥物有效部位、安全性等有待深入研究和評價，這急需大量中醫(yī)藥干預(yù)的動物實驗來篩選和指導(dǎo)臨床用藥。

4 小結(jié)與展望

我國乃至全球惡性腫瘤和心血管疾病的發(fā)病率居高不下，成為疾病致死的兩大首要原因，據(jù)推測本世紀內(nèi)放療可能仍是腫瘤治療的有效手段。RIHD的發(fā)生率短期內(nèi)不會有下降的趨勢。本文通過對動物實驗研究的回顧分析可以見得，RIHD的研究有限，中醫(yī)藥的干預(yù)研究也很少，深入探索放射性心臟損傷的病理分子機制，積極開展中醫(yī)藥的干預(yù)具有迫切的現(xiàn)實意義。