酸乳揮發(fā)性物質(zhì)與酶活的研究進(jìn)展

肖功年，魯安娜，陳波，趙廣生，袁海娜，龔金炎

（1浙江科技學(xué)院乳制品研究院，杭州 310023；2.浙江一鳴食品有限公司，浙江溫州 325400；3.杭州新希望雙峰乳業(yè)有限公司，杭州 310000）

0 前 言

酸奶是一種具有獨(dú)特感官特性的發(fā)酵乳制品，由于其獨(dú)特的營(yíng)養(yǎng)健康價(jià)值和良好風(fēng)味深受消費(fèi)者青睞，其風(fēng)味產(chǎn)生來(lái)源主要是由保加利亞乳桿菌(L.bulgaricus)和嗜熱鏈球菌(Str.theromophilus)在發(fā)酵過(guò)程中代謝產(chǎn)生[1]。酸奶的主要品質(zhì)特征包括質(zhì)地、口感和風(fēng)味[2-3]，研究表明，酸奶的品質(zhì)與所用原料乳類型[4-5]、發(fā)酵劑種類[6-7]和甜味劑[8-9]等密切相關(guān)。

風(fēng)味是酸奶質(zhì)量的一個(gè)重要指標(biāo)，同時(shí)也是消費(fèi)者考慮接受程度和偏好的重要因素。為了探究酸奶在發(fā)酵過(guò)程中風(fēng)味物質(zhì)的協(xié)同作用機(jī)理，國(guó)內(nèi)外一些學(xué)者對(duì)其代謝途徑和代謝調(diào)控方式開(kāi)展大量的研究工作[10-12]。本文從酶活研究進(jìn)展方面初步闡述酶活與酸奶風(fēng)味的關(guān)系，以期為相關(guān)深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的形成

乳制品的基本風(fēng)味主要來(lái)源于牛奶中的天然揮發(fā)性成分，受巴氏滅菌、發(fā)酵、加工和儲(chǔ)存等工藝的影響較大。在酸奶中發(fā)現(xiàn)的大量揮發(fā)性有機(jī)化合物不是由乳酸菌產(chǎn)生，而是來(lái)源于牛奶。牛奶是由水、蛋白質(zhì)、脂肪和礦物質(zhì)等組成的成分與結(jié)構(gòu)復(fù)雜的乳濁液，在牛奶產(chǎn)品中已經(jīng)鑒定出了400多種揮發(fā)性化合物[13]。這些芳香化合物由乳中存在的乳糖、脂質(zhì)、檸檬酸和蛋白質(zhì)，經(jīng)過(guò)微生物酶促和化學(xué)反應(yīng)轉(zhuǎn)化而產(chǎn)生[14]。存在于酸奶中的風(fēng)味化合物主要分為以下四大類：非揮發(fā)性酸（如乳酸、丙酮酸和檸檬酸）、揮發(fā)性酸（如乙酸、丙酸和丁酸）、羰基化合物（如乙醛、乙偶姻和雙乙酰）以及各種化合物（例如某些氨基酸）[5-6]。

酸奶產(chǎn)生風(fēng)味物質(zhì)的一個(gè)主要途徑是通過(guò)脂肪酸氧化。富含飽和脂肪酸的大量短鏈脂肪酸是產(chǎn)生風(fēng)味物質(zhì)的關(guān)鍵。當(dāng)存在自由基時(shí)，不飽和脂肪酸易被氧化形成氫過(guò)氧化物，其迅速分解形成己醛或不飽和醛[15]。不飽和脂肪酸也影響4-羥基酸或5-羥基酸的形成，其通過(guò)β-酮酸的脫羧將其輕度環(huán)化成γ-或δ-內(nèi)酯和奇數(shù)的碳甲基酮。另一個(gè)主要途徑是產(chǎn)酸細(xì)菌的乳糖、產(chǎn)生的乳酸和檸檬酸的轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生風(fēng)味化合物如乳酸、乙醛、雙乙酰、乙偶姻和乙醇。酸奶中的醇隨后可以與游離酸結(jié)合形成酯，如乙酸乙酯和乙酸丁酯。另外，生物胺和含氮化合物可以從蛋白質(zhì)和氨基酸轉(zhuǎn)化而來(lái)，硫化合物可以從有機(jī)硫化合物中衍生出來(lái)。關(guān)于酸奶和其它發(fā)酵乳制品中風(fēng)味化合物產(chǎn)生過(guò)程還有更多的細(xì)節(jié)[16]。

2 主要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)

食物中發(fā)現(xiàn)的揮發(fā)性化合物并不都具有感官上的重要影響。雖然在酸奶中發(fā)現(xiàn)了許多揮發(fā)性化合物，但只有其中一些化合物的濃度相對(duì)較高，例如乙醛、乙醇、丙酮、雙乙酰和2-丁酮[17]，可以在實(shí)驗(yàn)室中檢測(cè)到。Friendrich和Acree[18]研究表明，雙乙酰和乙醛在酸奶中有良好的調(diào)味效果，區(qū)別于其他發(fā)酵乳制品和牛奶。

2.1 乙醛

乙醛是羰基化合物中對(duì)酸奶風(fēng)味貢獻(xiàn)最大的化合物。純乙醛具有辛辣的刺激性氣味，但濃度較低時(shí)，會(huì)產(chǎn)生令人愉悅的水果香氣。Gezginc Y等[19]從土耳其酸奶中分離出的菌種的嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌的乙醛產(chǎn)生能力為0～105.9 mg/kg和0～126.9 mg/kg。Gaafar等[20]認(rèn)為當(dāng)產(chǎn)生適宜的乙醛水平（23～40 mg/kg和至少8～10 mg/kg）時(shí)，能得到良好風(fēng)味的酸奶。

2.2 雙乙酰

雙乙酰(又名丁二酮)，液體顏色呈黃色至綠色，稀釋至1 mg/L時(shí)呈奶油香味，易溶于甘油和水中，可以提高酪蛋白的風(fēng)味，對(duì)改善酸奶的風(fēng)味有很大影響。雙乙酰是由牛奶和乳品混合物中存在的檸檬酸發(fā)酵而來(lái)[21]。少量的雙乙酰，從痕量到0.90 mg/kg或更多，有助于產(chǎn)生令人愉快、細(xì)膩的香味和口味[22]。典型的酸奶中雙乙酰的濃度范圍為0.2 mg/kg～3 mg/kg[23]。乙偶姻為雙乙酰的還原形式，對(duì)酸奶風(fēng)味貢獻(xiàn)小，同時(shí)2,3-丁二醇為乙偶姻的還原形式，對(duì)酸奶風(fēng)味沒(méi)有貢獻(xiàn)。

2.3 乳酸

乳酸和其他酸也在酸奶的香味和風(fēng)味特性中起到特定的作用。雖然乳酸表現(xiàn)出較低的揮發(fā)性，但由于其風(fēng)味的重要性，所以在這里將其展開(kāi)討論。乳酸是許多發(fā)酵食品的風(fēng)味和功能的主要來(lái)源，并負(fù)責(zé)酸奶的清新酸味。在酸奶生產(chǎn)過(guò)程中，乳中約20%～40%的乳糖轉(zhuǎn)化為乳酸，酸奶中的乳酸含量約為0.9%。酸味是感知酸奶味道的重要因素，酸奶的p H值通常在4.4左右。Panagiotidis和Tzia[24]表明，乳酸和乙醛很大程度上有助于酸奶的典型風(fēng)味和香氣。Tari C[25]研究確定了使用日期產(chǎn)品的乳酸含量為23.6 mg/mL，比Nancip等人研究確定的乳酸含量高了近10倍。

3 風(fēng)味物質(zhì)與酶活關(guān)系

3.1 β-半乳糖苷酶

乳糖代謝過(guò)程中，β-半乳糖苷酶作為關(guān)鍵酶，能水解乳糖生成半乳糖和葡萄糖，故能有效緩解乳糖不耐癥。葡萄糖進(jìn)一步通過(guò)糖酵解途徑生成乳酸及其他代謝產(chǎn)物，對(duì)酸奶的風(fēng)味口感產(chǎn)生影響。有研究表明，雙乙酰和乙醛產(chǎn)生量與乳糖代謝途徑密切相關(guān)。

隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的增加，β-半乳糖苷酶的活力不斷降低，這是因?yàn)楦靼l(fā)酵乳中乳糖經(jīng)過(guò)β-半乳糖苷酶的分解產(chǎn)生的乳酸，抑制了β-半乳糖苷酶的活性，說(shuō)明β-半乳糖苷酶活力高的菌株能產(chǎn)生更多的乳酸[26]。β-半乳糖苷酶活性的高低都可能有效緩解乳糖不耐癥，但β-半乳糖苷酶的酶活力并不是越高越好，因?yàn)橛醒芯勘砻鳓?半乳糖苷酶與酸奶的后酸化有關(guān)[27]。

3.2 乳酸脫氫酶

葡萄糖代謝途徑中，丙酮酸作為重要的中間代謝產(chǎn)物，在乳酸脫氫酶的作用下脫氫生成乳酸，此外還可通過(guò)丙酮酸的代謝支流形成雙乙酰和乙醛。乳酸脫氫酶的酶活在整個(gè)儲(chǔ)藏期間基本處于下降趨勢(shì)，比酶活呈先下降后上升的趨勢(shì)，這說(shuō)明乳酸脫氫酶的比酶活并沒(méi)有受到低p H高酸度的影響[27,28]。

德氏乳桿菌（Lactobacillus delbrueckii）亞種保加利亞乳桿菌是使用D-乳酸脫氫酶（DLDH）將丙酮酸鹽主要轉(zhuǎn)化為D-乳酸的非均勻乳酸菌，其功能特性仍然不佳，進(jìn)一步的研究表明，乳酸脫氫酶活性受氧下調(diào)，因此在厭氧條件下達(dá)到最高的D-乳酸滴度為1.94 g/L[29]。D-乳酸是德氏乳桿菌的主要乳酸產(chǎn)物，但不能被人體腸道代謝，Zhang J等[30]進(jìn)一步研究了氨基酸水平上D-LDH和L-LDH基因的進(jìn)化，發(fā)現(xiàn)德氏乳桿菌D-LDH基因是正向選擇的，可能是長(zhǎng)期馴化的結(jié)果。Viana R[31]發(fā)現(xiàn)干酪乳桿菌有兩種特征基因編碼乳酸脫氫酶活性，它特別催化了L-乳酸的形成。

3.3 葡萄糖激酶

葡萄糖激酶是糖酵解途徑（EMP途徑）的關(guān)鍵酶，并且是EMP途徑的第一步反應(yīng)所需要的酶。葡萄糖進(jìn)入細(xì)胞后首先發(fā)生磷酸化反應(yīng)，生成的6-磷酸葡萄糖無(wú)法進(jìn)出細(xì)胞膜而逃離細(xì)胞[32]。

3.4 乳糖通透酶

乳糖通透酶是屬于主要輔助因子超家族（MFS）的次級(jí)活性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（SAT）。已經(jīng)確定了胞質(zhì)開(kāi)放的乳糖通透酶結(jié)構(gòu)。乳糖通透酶和β-半乳糖苷酶共同作用下可以加速乳糖分解。乳糖通透酶先將乳糖磷酸化后進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，并在β-半乳糖苷酶的水解作用下，分解成葡萄糖和半乳糖[33]。其中，一部分葡萄糖優(yōu)先被乳酸菌代謝掉，通過(guò)EMP途徑，最終產(chǎn)生乳酸。大腸桿菌的乳糖通透酶利用其中糖和H+結(jié)合位點(diǎn)交替進(jìn)入膜兩側(cè)的機(jī)制來(lái)催化半乳糖苷與H+的化學(xué)計(jì)量協(xié)調(diào)[34]。

3.5 丙酮酸激酶

丙酮酸激酶是EMP途徑最后一步所需要的酶，也是EMP途徑中的關(guān)鍵限速酶之一。在EMP途徑中，丙酮酸激酶在K+和Mg2+存在的條件下，可以催化磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和二磷酸腺苷(ADP)并且釋放出能量轉(zhuǎn)移到ATP中，最終生成丙酮酸，生成的丙酮酸不僅可以在乳酸脫氫酶(LDH)的作用下生成乳酸，還可以在丙酮酸脫羧酶作用下生成乙醛，對(duì)酸奶風(fēng)味產(chǎn)生影響[27]。

3.6 α-乙酰乳酸脫羧酶

α-乙酰乳酸脫羧酶是檸檬酸代謝途徑中生成雙乙酰的重要酶。丙酮酸在α-乙酰乳酸合成酶作用下合成α-乙酰乳酸，在α-乙酰乳酸脫羧酶的催化下極易脫羧生成乙偶姻[35]。α-乙酰乳酸在氧化脫羧反應(yīng)下生成雙乙酰，一部分由雙乙酰還原酶作用轉(zhuǎn)化為乙偶姻，乙偶姻在乙偶姻還原酶的作用下降解為丁二醇，乙偶姻和丁二醇的味閾值較高，對(duì)酸度風(fēng)味影響不大，但雙乙酰對(duì)酸奶的風(fēng)味影響很大，故可以從調(diào)控α-乙酰乳酸脫羧酶與雙乙酰的協(xié)同作用研究。

4 結(jié)論與展望

揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)中的雙乙酰、乙醛和乳酸對(duì)酸奶風(fēng)味貢獻(xiàn)突出，并對(duì)酸奶的氣味和口感起到重要作用。酸奶中β-半乳糖苷酶與乳酸脫氫酶對(duì)乳酸的生成影響很大，可以通過(guò)調(diào)節(jié)酶活控制酸奶后酸化問(wèn)題。β-半乳糖苷酶、α-乙酰乳酸脫羧酶、葡萄糖激酶、乳糖通透酶和丙酮酸激酶的酶活對(duì)酸奶中雙乙酰、乙醛的產(chǎn)量有很大相關(guān)性。探究酸奶中的酶與揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的關(guān)系，有助于酸奶風(fēng)味物質(zhì)的形成機(jī)理研究。

酸奶揮發(fā)性物質(zhì)成分與酶活的研究進(jìn)展為酸奶品質(zhì)的提高和品質(zhì)的控制提供了依據(jù)。通過(guò)調(diào)節(jié)酸奶中的酶活，為控制雙乙酰、乙醛在酸奶中的量提供一個(gè)新的方法，能有助于我們進(jìn)一步研究酸奶在貯藏、運(yùn)輸過(guò)程中風(fēng)味物質(zhì)的變化機(jī)理，生產(chǎn)出口感更好的酸奶產(chǎn)品。