響應(yīng)面法優(yōu)化百香果酸奶的發(fā)酵工藝

周鮮嬌，楊勇捷，黃施華，潘進權(quán)，陳蓉，饒穎竹

（嶺南師范學院生命科學與技術(shù)學院，廣東 湛江 524048）

0 引 言

百香果(Passionfruit)為西番蓮科(Passifloraceaee)西番蓮屬(Passiflora L.)，是一種多年生常綠藤本植物的果實[1,2]，其營養(yǎng)豐富[3]，香氣濃郁，口感酸甜，保健功效好，適宜各類人群食用[4]。

酸奶富含各種營養(yǎng)物質(zhì)、活性物質(zhì)及活性乳酸菌等，可促進人體腸道內(nèi)乳酸菌的生長，調(diào)節(jié)人體腸道中的微生物菌群平衡，改善腸道功能。Tomas-MSJ等[5]和Arakawa等[6]研究發(fā)現(xiàn)乳桿菌產(chǎn)生細菌素對致病菌有顯著的抑制作用，具有清腸道、降固醇、預(yù)防老年人心血管疾病等保健功效。近年來，我國酸奶產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，各種果蔬和糧食等口味的風味酸奶[7-10]應(yīng)運而生，相比于蔬和糧食酸奶，百香果營養(yǎng)豐富和香味獨特—百果之香，這使其更適合作為風味酸奶制作的原料之一。百香果酸奶具有色、香、味等口感俱全的特色，其營養(yǎng)也更全面。目前，對于百香果酸奶的研究報道鮮見[3]本研究通過響應(yīng)面法優(yōu)化百香果酸奶發(fā)酵工藝，旨在分析出百香果酸奶的最優(yōu)發(fā)酵條件，為百香果風味酸奶的研制提供科學的工藝參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料

奶粉(伊利牌高蛋白脫脂高鈣奶粉)，百香果(市售新鮮紫香百香果),白砂糖；菌粉：川秀乳酸菌酸奶發(fā)酵粉（保加利亞乳桿菌(Lactobacillus bulgaricus)：嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)為1∶1）。

1.1.2 培養(yǎng)基

MRS肉湯，結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂(VRBA)，煌綠乳糖膽鹽(BGLB)肉湯。

1.1.3 儀器設(shè)備

SPX-250B-Z生化培養(yǎng)箱，YXQ-LS-18SI手提式壓力蒸汽滅菌器，SW-CJ-2FD潔凈工作臺，SQP電子天平，BCD-402WDBA海爾冰箱。

1.2 方法

1.2.1 工藝流程及操作要點

取百香果果肉搗碎，經(jīng)無菌紗布過濾留汁并殺菌冷卻，得百香果果汁；將脫脂奶粉與白糖混合、溶解，并殺菌冷卻，得無菌奶液；菌粉用溫開水溶解，以備接種。

1.2.2 百香果酸奶制作流程

混勻果汁、無菌奶液→接種→混勻→分裝→發(fā)酵→4℃冷藏24 h后熟→成品

混勻

1.2.3 單因素實驗設(shè)計

發(fā)酵時間設(shè)定為5 h時，分別比較不同奶粉添加量（6 g/100 mL、9 g/100 mL、12 g/100 mL、15 g/100 mL、18 g/100 mL）白糖添加量（5 g/100 mL、7 g/100 mL、9 g/100 mL、11 g/100 mL、13 g/100 mL）、百香果果汁添加量（0%、2%、4%、6%、8%）、發(fā)酵溫度（40℃、41℃、42℃、43℃、44℃）和菌粉添加量（1∶500、1∶1000、1∶1500、1∶2000、1∶2500，均為質(zhì)量體積比）對百香果酸奶品質(zhì)的影響。

1.2.4 Plackett-Burman實驗設(shè)計

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以百香果酸奶感官評分為響應(yīng)值，利用Design-Expert.V8.0.6進行PB試驗的設(shè)計試驗設(shè)計如表1所示。

表1 PB試驗因素與水平

1.2.5 最陡爬坡實驗設(shè)計

在PB實驗的基礎(chǔ)上，對篩選得出的顯著因子進行合理設(shè)計，從而獲得最佳工藝區(qū)域的方法，并將此最佳結(jié)果作為響應(yīng)面試驗的中心點展開實驗[11]。

1.2.6 響應(yīng)面實驗設(shè)計

利用Design-Expert 8.0.6進行Box-Behnken實驗的設(shè)計，設(shè)計因素及對應(yīng)水平如表2所示。

表2 Box-Behnken設(shè)計實驗因素與水平

1.2.7 酸奶測定項目及標準

1.2.7.1 感官評定

隨機邀請10位同學組成鑒評小組，參照國家酸乳衛(wèi)生標準GB/T19302-2010[12]，根據(jù)成品的色澤、滋味、氣味、狀態(tài)等進行綜合評分。除去一個最高分和一個最低分后取平均值作為最后感官評分。評分標準如表3所示。

表3 感官指標評定

1.2.7.2 理化和微生物指標

酸度數(shù)值以°T表示，具體操作方法見GB/T 5413.34-2010[19]。乳酸菌數(shù)≥1×106mL-1，方法詳見GB/T 4789.35-2016[23]；大腸菌群（最近似值）≤0.003 mL-1，方法詳見GB/T 4789.3-2008[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 百香果果汁添加量的確定

由圖1可以看出，百香果果汁添加量對酸奶的品質(zhì)有明顯影響,感官評分隨百香果汁添加量的增加呈先升高后降低的趨勢。當不添加果汁時，酸奶風味較淡，感官評分為68；當添加量為6%時，酸奶具有百香果獨特香味、凝乳好、口感佳，感官評分最高，為84分；當添加量達到8%時，酸奶較粗糙，缺少細膩感，綜合品質(zhì)明顯降低。因此，6%的果汁添加量最佳。

圖1 百香果果汁添加量對酸奶品質(zhì)的影響

2.1.2 奶粉添加量的確定

圖2表明，脫脂奶粉添加量對酸奶品質(zhì)的影響很大,感官評分隨脫脂奶粉添加量的增加呈先升高后緩慢降低的趨勢。奶粉添加量為6%和9%時，酸奶有大量乳清析出，凝乳不均勻；奶粉添加量小于12%時，增加奶粉的添加量可使酸奶更具稠厚感，凝乳更均勻，口感更細膩，酸奶品質(zhì)明顯提高；但當奶粉添加量大于12%時，奶粉添加量對酸奶的品質(zhì)影響不顯著，感官評分差值不大，因此以12%奶粉添加量為最佳值。

2.1.3 白糖添加量的確定

圖3可以看出，白糖添加量對酸奶品質(zhì)的影響極為明顯。感官評分隨白糖添加量的添加呈現(xiàn)先升后降的趨勢，白糖添加量為7%時，感官評分最高；當糖添加量增至9%時，酸奶口感過甜；添加量為13%時，酸奶凝乳不均勻、稠厚感差、甜度無法適口。因此7%的糖添加量最為合適。

圖2 脫脂奶粉添加量對酸奶品質(zhì)的影響

圖3 白糖添加量對酸奶品質(zhì)的影響

2.1.4 發(fā)酵溫度的確定

由圖4可以看出，發(fā)酵溫度對酸奶品質(zhì)的影響較大，高于43℃時，酸奶品質(zhì)劇急下降；發(fā)酵溫度42℃時，酸奶口感和組織機構(gòu)最佳，評分85最高；發(fā)酵溫度43℃時，酸奶口感潤滑度下降，發(fā)酵溫度44℃時，酸奶則產(chǎn)生大量乳清，凝乳不均勻，酸奶原有香味改變。因此選擇42℃為最佳發(fā)酵溫度。

圖4 發(fā)酵溫度對酸奶品質(zhì)的影響

2.1.5 菌粉添加量的確定

由圖5可以看出，當菌粉與奶果混合液1∶1000（質(zhì)量濃度比）混合發(fā)酵時，酸奶凝乳最好，感官評分為86分；而在菌種添加量遞減過程中，酸奶品質(zhì)隨之下降；當添加量為菌粉∶混合液=1∶2500時，酸奶凝乳不均勻，香味不明顯，口感稀薄，綜合品質(zhì)最差。因而可得，菌粉最佳添加量為1∶1000。

2.2 Plackett-Burman實驗設(shè)計

表4和表5為PB實驗設(shè)計及結(jié)果分析。由表5可以看出，PB實驗的模型P值為0.0004（小于0.01），達到極顯著，該模型具有統(tǒng)計學意義。從各因素的P值可知，各因素對酸奶品質(zhì)的影響力從高到低為果汁添加量＞白糖添加量＞發(fā)酵溫度＞奶粉添加量＞菌粉添加量，其中果汁添加量、白糖添加量、發(fā)酵溫度達極顯著水平（P＜0.01）。從系數(shù)估值可知，白糖添加量和發(fā)酵溫度對酸奶品質(zhì)呈正效應(yīng)影響，其余因素為負效應(yīng)影響。選擇Box-Behnken試驗時至少需要3個因素，因此，結(jié)合各因素的P值大小，選擇果汁添加量、白糖添加量和發(fā)酵溫度這3個因素進行最陡爬坡實驗。

圖5 菌粉添加量對酸奶品質(zhì)的影響

表4 Plackett-Burman實驗設(shè)計

表5 Plackett-Burman實驗結(jié)果分析

2.3 最陡爬坡實驗

從PB實驗結(jié)果可知，白糖添加量和發(fā)酵溫度為正效應(yīng)，果汁添加量為負效應(yīng)，則適當提高白糖添加量和發(fā)酵溫度，減小果汁添加量有利于提高酸奶品質(zhì)。最陡爬坡試驗是根據(jù)因素的正負效應(yīng)及實際情況，確定爬坡方向和合理的步長，以達到快速逼近最佳區(qū)域的目的。由表6可知，最佳的組合為實驗號2，即果汁添加量為5.5%、白糖添加量為7.5%、發(fā)酵溫度42.5℃，故以實驗號2的條件為Box-Behnken實驗設(shè)計的中心值。

表6 最陡爬坡實驗結(jié)果

2.4 響應(yīng)面實驗

響應(yīng)面實驗設(shè)計與結(jié)果如表7所示。

表7 Box-Behnken實驗設(shè)計與結(jié)果

2.4.1 響應(yīng)面實驗方差分析

在PB實驗和最陡爬坡實驗的基礎(chǔ)上，利用Design-Expert.V8.0.6軟件進行Box-Behnken實驗設(shè)計，結(jié)果如表7所示；方差分析如表8所示。通過對試驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得到響應(yīng)面回歸模擬方程為感官評分=+93.40+0.75A－1.62B+1.88E+0.75AB－1.25AE－1.00BC－1.95A2－3.20B2－3.20E2。由表8可以看出，模型P＜0.0001，達極顯著。失擬項P=0.1234＞0.1，不顯著，表明模型對本試驗的擬合度良好。回歸系數(shù)R2=0.9758，模型擬合度良好，R2Adj=0.9448，說明該模型能解釋94.48%響應(yīng)值的變化，可用于百香果酸奶發(fā)酵工藝參數(shù)的優(yōu)化。由各因素的P值可知，交互項AE，BE和一次項A(P＜0.05)影響顯著；B，E，A2，B2和E2影響均達極顯著(P＜0.01)；結(jié)果說明該3個因素對百香果酸奶發(fā)酵的影響顯著，且存在交互作用。

表8 響應(yīng)面實驗方差分析

2.4.2 響應(yīng)面分析

從圖6的響應(yīng)面圖可知本實驗的模型存在最大值，依據(jù)模型擬合結(jié)果，百香果酸奶發(fā)酵的最佳工藝為：果汁添加量5.51%，白糖添加量7.35%，發(fā)酵溫度42.67℃，百香果酸奶的感官評分預(yù)測值為93.9705。為便于操作，修訂發(fā)酵工藝參數(shù)為：果汁添加量5.5%，白糖添加量7.4%，發(fā)酵溫度42.7℃。在此條件下，百香果酸奶的感官評分達到94.33分，與預(yù)測值接近。

圖6的等高線圖可直觀地反映出2個變量對百香果酸奶品質(zhì)的影響顯著程度，三個等高線圖顯示這三個因素兩兩均存在著交互作用，且交互作用顯著。

2.5 酸奶成品質(zhì)量檢測結(jié)果

2.5.1 感觀評價

按照響應(yīng)面法得出最佳的發(fā)酵工藝，發(fā)酵得出百香果酸奶色澤均勻，為淺黃色；組織細膩，凝乳均勻，口感潤滑，僅有極少量乳清析出，無分層、氣泡；乳香和百香果特有香味濃郁，氣味清新，且甜度適口，感官評分達94.33。

2.5.2 理化與微生物檢測結(jié)果

成品酸度為73°T，乳酸菌為5.8×108mL-1，大腸桿菌沒有檢出。

3 結(jié)論

本實驗通過單因素實驗、Plackett-Burman實驗、最陡爬坡實驗和響應(yīng)面優(yōu)化發(fā)酵法確定了百香果酸奶最佳發(fā)酵工藝。結(jié)果表明：以果汁添加量、白砂糖添加量和發(fā)酵溫度為自變量，響應(yīng)面法優(yōu)化得出百香果酸奶的最佳發(fā)酵工藝為白糖添加量7.4%，接種量0.1%，百香果果汁添加量5.5%，發(fā)酵溫度42.7℃，發(fā)酵時間5 h。在此條件下，酸奶感官評分約達到94.33分，與預(yù)測值（93.9705分）基本相符，此結(jié)果可充分驗證該試驗?zāi)Ｐ偷目煽啃?。實驗檢測出百香果酸奶的酸度為73°T，乳酸菌檢測數(shù)為5.8×108mL-1，大腸桿菌沒有檢測出。本實驗研制的百香果酸奶的品質(zhì)完全符合國家發(fā)酵乳的標準[15]。

圖6 兩兩因素交互作用對酸奶品質(zhì)影響的響應(yīng)面與等高線圖