凱氏定氮儀測(cè)定飼料中粗蛋白含量誤差因素分析

丁立人

摘? 要：利用全自動(dòng)凱氏定氮儀的工作原理，通過(guò)對(duì)各實(shí)驗(yàn)操作步驟中有可能產(chǎn)生誤差的來(lái)源作了詳細(xì)的分析，從而達(dá)到減小實(shí)驗(yàn)誤差，提高檢測(cè)準(zhǔn)確性的目的。

關(guān)鍵詞：凱氏定氮儀;蛋白質(zhì)含量;誤差;準(zhǔn)確度

中圖分類號(hào)：S-3? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? DOI：10.11974/nyyjs.20181131006

飼料中粗蛋白質(zhì)含量是飼料質(zhì)量的一個(gè)重要指標(biāo)，目前常用的檢測(cè)方法是凱氏定氮法，其通過(guò)測(cè)定樣品中總氮量來(lái)計(jì)算樣品蛋白質(zhì)含量，適用于各類樣品中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定，國(guó)內(nèi)外應(yīng)用較為普遍，迄今為止仍是飼料中蛋白質(zhì)測(cè)定的國(guó)標(biāo)規(guī)定方法。

全自動(dòng)凱氏定氮儀同傳統(tǒng)的半微量凱氏蒸餾裝置相比，全自動(dòng)凱氏定氮儀的定氮原理與之相同，并具有省時(shí)、省力、準(zhǔn)確性高等優(yōu)點(diǎn)，因而在飼料行業(yè)得到廣泛應(yīng)用。但測(cè)定粗蛋白的步驟依然繁多，每個(gè)步驟、每個(gè)細(xì)節(jié)都有可能人為因素造成誤差，從而表現(xiàn)為結(jié)果的偏低、偏高以及重復(fù)性不好等幾種形式。本文以FOSS? Kjeltec8400型全自動(dòng)凱氏定氮儀為例，通過(guò)對(duì)其整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程的整理，根據(jù)實(shí)驗(yàn)操作的先后順序，對(duì)各步驟中誤差產(chǎn)生的可能因素和來(lái)源進(jìn)行分析，并提出相應(yīng)的避免或降低誤差的解決方法。

1? ? ?方法原理

凱氏定氮法測(cè)定飼料中蛋白質(zhì)的原理是各種飼料在催化劑（硫酸鉀、硫酸銅）的作用下，用濃硫酸進(jìn)行消化，使蛋白質(zhì)和氨態(tài)氮都轉(zhuǎn)變成氨氣，并被濃硫酸吸收變?yōu)榱蛩徜@，而非含氮物質(zhì)，則以二氧化碳、水、二氧化硫的氣體狀態(tài)逸出。消化液在濃堿的作用下進(jìn)行蒸餾，釋放出的氨氣隨水蒸氣蒸出并被硼酸液吸收生成硼酸胺，以甲基紅-溴甲酚綠作混合指示劑，用鹽酸標(biāo)準(zhǔn)液滴定，求出氮的含量，再乘以一定的換算系數(shù)（通常用6.25系數(shù)計(jì)算），得出樣品中的粗蛋白質(zhì)的含量。

其主要化學(xué)反應(yīng)如下：

2CH3CHNH2COOH+13H2S04（NH4）2SO4+6CO2+12SO2+16H2O

NaOH+（NH3）2S04? ? ?2NH3+2H2O+Na2SO4

H3BO3+NH3? ? ?NH4H2BO3

NH4H2BO3+HCl? ? H3BO3+NH4Cl

2? ? ? 誤差來(lái)源分析及解決措施

2.1? ? ?樣品制備環(huán)節(jié)

2.1.1? ? ?樣品的取樣

測(cè)定要求樣品粉碎并全部過(guò)40目篩，目的在于使其具備均質(zhì)性，便于溶樣，更易于消化。在粉碎或過(guò)篩過(guò)程中，樣品容易產(chǎn)生自動(dòng)分級(jí)，如玉米，其硬質(zhì)顆粒大的部分常聚集在上面，粉質(zhì)部分聚在下面。所以粉碎過(guò)篩后要重新混合均勻，以減少測(cè)量誤差。

粉碎完后，粉碎機(jī)中總會(huì)遺留少部分，這部分不能隨便丟棄，否則將影響樣品的均質(zhì)性造成測(cè)量誤差。

對(duì)于全價(jià)料（即使是顆粒全價(jià)料）和濃縮料，無(wú)須再粉碎，當(dāng)然這是基于混合機(jī)的良好混合均度的;如果拿去粉碎，會(huì)丟失部分粉末物質(zhì)，且粉碎后產(chǎn)生分級(jí)，反而降低了樣品的均質(zhì)性，因此測(cè)定的樣品一定要均勻，不均勻的樣品會(huì)導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果重復(fù)性差，結(jié)果或高或低。

2.1.2? ? ?樣品的用量

在進(jìn)行樣品稱量時(shí)2點(diǎn)很關(guān)鍵：樣品的質(zhì)量或體積的準(zhǔn)確性以及最合適的上樣量。

當(dāng)固體樣的稱量質(zhì)量高于實(shí)際質(zhì)量或液體樣品的量取體積大于實(shí)際的體積時(shí)， 就會(huì)導(dǎo)致最后定氮結(jié)果偏低。反之，則會(huì)導(dǎo)致定氮結(jié)果偏高。因此，稱量用天平一定要定期校正，液體樣品量取也要使用經(jīng)過(guò)校正的移液器，以確保樣品的質(zhì)量或體積準(zhǔn)確性。

樣品的稱取在0.5～1g左右比較適宜，對(duì)于魚粉、豆粕、濃縮料等粗蛋白含量較高的樣品，稱量0.5g左右即可，而對(duì)于玉米、稻谷蛋白含量低的樣品，適當(dāng)增加稱量至1g左右，如果取樣太少，鹽酸標(biāo)準(zhǔn)液滴定體積過(guò)小，增加實(shí)驗(yàn)誤差，取樣太多，消化時(shí)消耗的硫酸量大，消化不完全，導(dǎo)致結(jié)果偏低。同時(shí)，如果上樣量超出儀器的檢測(cè)范圍也會(huì)導(dǎo)致定氮結(jié)果不準(zhǔn)確。以FOSS Kjeltec 8400型全自動(dòng)凱氏定氮儀為例，一般單次凱氏定氮檢測(cè)的樣品總含氮量應(yīng)在 0.1～200mg。

2 .1.3? ? ?消化管清潔不徹底

消化管如果清潔不徹底可能會(huì)有樣品殘留，從而導(dǎo)致定氮結(jié)果偏高。所以，每次實(shí)驗(yàn)稱量前要確保消化管清洗干凈，稱量紙應(yīng)是無(wú)氮紙或者是定量濾紙，否則結(jié)果偏高。

樣品放入消化管內(nèi)時(shí)，注意不要粘附在管壁上，萬(wàn)一有粘附可用少量濃硫酸將其緩慢沖下，以免被檢樣消化不完全，結(jié)果偏低。

2.2? ? ?樣品消煮環(huán)節(jié)

2.2.1? ? ?消化爐溫度的控制

開始消化時(shí)消化爐要調(diào)低至200℃，待樣品焦化，泡沫消失后，逐步緩慢加強(qiáng)火力，直至升到420℃，爐溫過(guò)低消化時(shí)間長(zhǎng)且不完全，過(guò)高會(huì)引起氮的損失，都會(huì)導(dǎo)致粗蛋白的結(jié)果偏低。水分含量高、糖分、油脂高的樣品易起泡，可將催化劑和硫酸加入消化管內(nèi)靜置過(guò)夜再逐步升溫消化，可在一定程度上減少發(fā)泡現(xiàn)象的產(chǎn)生，防止氮的損失。

2.2.2? ? ?硫酸與催化劑的比例

硫酸與催化劑的最佳比例為1.7（10mL硫酸，6g左右催化劑），提高沸點(diǎn)到385℃。比例不對(duì)，沸點(diǎn)達(dá)不到，消化不完全，結(jié)果偏低。

2.2.3? ? ?排廢速率

排廢的速率過(guò)高時(shí)，硫酸的消耗就會(huì)加快，參與消化的硫酸量會(huì)減少，從而使樣品消化不完全而導(dǎo)致定氮結(jié)果偏低。因此在消化剛開始把抽氣泵開到最大，約5～8min后關(guān)小抽氣泵降低排廢速度以致酸霧恰好充滿排廢罩保證硫酸回流，避免氨的損失。

2.2.4? ? ?消化時(shí)間

樣品的消化時(shí)間對(duì)飼料中粗蛋白質(zhì)測(cè)定也很重要，樣品消化至透明藍(lán)綠色液體再消化15min，說(shuō)明消化完全，消化時(shí)間過(guò)短，飼料中的氮不能充分轉(zhuǎn)化成氨;消化時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，酸消耗量過(guò)大，會(huì)造成氨的流失。

2.3? ? ?蒸餾環(huán)節(jié)

2.3.1? ? ?接收液的pH值

接收液為加指示劑的1%硼酸水溶液，正常顏色顯示暗紅色，如果溶液是紅色，pH值偏酸，則應(yīng)用5%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)至暗紅色，反之接收液顏色偏綠，則需加5%鹽酸溶液調(diào)至暗紅，以確保接收液呈中性，避免接收液pH值不準(zhǔn)確造成的結(jié)果誤差。

2.3.2? ? ?蒸餾頭變形或有異物

當(dāng)蒸餾頭上腐蝕變形或附著雜質(zhì)固體異物，消化管與蒸餾頭之間密封不嚴(yán)，就會(huì)引起氨氣甚至液體泄漏，使定氮結(jié)果偏低。另外，多次實(shí)驗(yàn)之后由于清洗不徹底，蒸餾頭上殘留的有機(jī)氮雜質(zhì)可能會(huì)在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中計(jì)入正在蒸餾的樣品當(dāng)中，導(dǎo)致定氮結(jié)果偏高。因此，蒸餾頭應(yīng)定期用醋酸水溶液進(jìn)行清洗，如發(fā)現(xiàn)蒸餾頭腐蝕老化應(yīng)更換蒸餾頭。

2.3.3? ? ?氫氧化鈉溶液的用量

在樣品消化完全后，樣品上機(jī)會(huì)加入濃堿液（一般為400g/L的氫氧化鈉溶液 ） 使之呈堿性后進(jìn)行加熱蒸餾，使氨氣釋放。堿液的加入體積一般是硫酸體積的4倍以上，通常10～12mL硫酸消化，儀器程序設(shè)定50mLNaOH溶液，使反應(yīng)液蒸餾過(guò)程保持褐色，說(shuō)明堿足量，這樣才能使氨完全游離，易于硼酸吸收。如果堿量不足時(shí)，會(huì)使得氨氣釋放不徹底從而引起最終定氮結(jié)果偏低，同時(shí)為了避免這種情況，并檢查堿泵輸送的體積是否正確，堿泵要定期用溫水清洗，避免供堿系統(tǒng)堵塞。

2.3.4? ? ?蒸餾時(shí)間

當(dāng)樣品的含氮量較高而蒸餾的時(shí)間又過(guò)短時(shí)，蒸餾反應(yīng)會(huì)不充分，氨氣釋放不完全，導(dǎo)致最終的定氮結(jié)果偏低。遇到這種情況應(yīng)適當(dāng)?shù)难娱L(zhǎng)蒸餾時(shí)間，確保樣品的氨氣充分釋放;或者適當(dāng)減少樣品量，確保反應(yīng)完全。蒸餾同時(shí)做好定氮儀系統(tǒng)密封性檢查，保證接口密封不漏液，有利氨蒸餾。

2.4? ? ?滴定環(huán)節(jié)

2.4.1? ? ?鹽酸標(biāo)準(zhǔn)液濃度的影響

鹽酸標(biāo)準(zhǔn)液濃度是否準(zhǔn)確尤為關(guān)鍵，如果標(biāo)準(zhǔn)酸的濃度偏高時(shí)，消耗標(biāo)準(zhǔn)酸的體積就會(huì)偏少，從而使最終的定氮結(jié)果偏低，反之則結(jié)果偏高。所以標(biāo)準(zhǔn)酸溶液標(biāo)定時(shí)，增加平行標(biāo)定的次數(shù)，可以減少隨機(jī)誤差。在一般分析工作中，測(cè)定次數(shù)為3～5次，如果沒有意外誤差發(fā)生，基本上可以得到比較準(zhǔn)確的標(biāo)定結(jié)果，同時(shí)妥善保存標(biāo)液以防止?jié)舛劝l(fā)生變化，影響定氮結(jié)果。

2.4.2? ? ?滴定系統(tǒng)中存在氣泡

滴定系統(tǒng)中如果混有氣泡，氣泡占據(jù)標(biāo)準(zhǔn)鹽酸的體積，使得計(jì)量的酸量就會(huì)大于實(shí)際量，從而導(dǎo)致結(jié)果偏高。為了避免這種情況，每次實(shí)驗(yàn)前要檢查滴定系統(tǒng)，具體操作是采用手動(dòng)排液和充滿液體的方法將滴定系統(tǒng)內(nèi)的氣泡排出，并手動(dòng)清洗干凈滴定室，使得滴定室不再有殘余的酸。

2.4.3? ? ?空白值的影響

空白值檢測(cè)是衡量整個(gè)操作過(guò)程中一個(gè)非常重要的指標(biāo)，良好的空白值是保證檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確的前提。空白值偏高，那么在樣品滴定時(shí)標(biāo)準(zhǔn)酸的實(shí)際消耗體積就會(huì)降低，從而導(dǎo)致最終的定氮結(jié)果偏低。引起空白值偏高的原因主要是消化管未清洗干凈，或者是有污染物殘留反應(yīng)管道。所以，測(cè)定用的消化管要徹底清潔;蒸餾頭應(yīng)定期用醋酸水溶液進(jìn)行清洗，確保沒有有機(jī)氮的殘留。

3? ? ?結(jié)語(yǔ)

應(yīng)用全自動(dòng)凱氏定氮儀測(cè)定飼料中的粗蛋白含量，大大提高了檢測(cè)效率，而通過(guò)以上的分析，對(duì)全自動(dòng)凱氏定氮儀測(cè)定粗蛋白可能的誤差來(lái)源有個(gè)全面正確認(rèn)識(shí)，并在日常測(cè)定中掌握正確的操作方法，避免每個(gè)環(huán)節(jié)人為因素的影響，一定能將誤差控制在最小范圍，提高測(cè)定樣品粗蛋白含量的準(zhǔn)確度。