產(chǎn)淀粉酶菌株分離篩選實(shí)驗(yàn)的顯色方法改進(jìn)

陳國華+劉朝霞+蘇香萍

摘 要 “產(chǎn)淀粉酶菌株分離篩選”實(shí)驗(yàn)是微生物類重要實(shí)驗(yàn)之一，但是常用的碘液顯色法需要臨時(shí)配制顯色液，保存期短，而固體碘顯色法難以掌握合適的顯色程度；改用絡(luò)合碘顯色法，可以清晰地觀察到產(chǎn)淀粉酶菌株特征，使用方便、效果穩(wěn)定。

關(guān)鍵詞 產(chǎn)淀粉酶菌株 菌株篩選 顯色方法改進(jìn)

中圖分類號(hào)：Q642.477 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI：10.16400/j.cnki.kjdks.2017.11.020

Abstract Screening of amylase-producing microorganisms is a key experiment for college micrology course， and in this process， iodine– starch staining was used to identify transparent zone created due to hydrolysis of starch by microbial amylase. When iodine solution was applied as staining agent， it would be prepared， and furthermore， iodine solution just has short storage time. If solid iodine was used， the coloration time was difficult to control. Iodine-containing clathrate can used as starch staining agent， and it is effective and convenient.

Keywords amylase-producing microorganisms； microbial screening method； modification of coloration method

“產(chǎn)淀粉酶菌株分離篩選”實(shí)驗(yàn)是微生物綜合性實(shí)驗(yàn)以及發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)的重要組成部分。淀粉酶是水解淀粉和糖原酶類的總稱，在食品、醫(yī)藥、飼料等領(lǐng)域廣泛使用，是工業(yè)生產(chǎn)和應(yīng)用領(lǐng)域使用量最大的酶制劑，約占酶市場25%的份額。[1， 2]自1894年第一個(gè)工業(yè)化淀粉酶來源于真菌以來，微生物淀粉酶已經(jīng)非常成功地替代了化學(xué)方法水解淀粉。[3]

淀粉酶對(duì)于工業(yè)生產(chǎn)的重要性已經(jīng)引起了廣泛關(guān)注，而微生物作為高活性淀粉酶獲取的重要資源，促使人們不斷地從自然界中篩選新型的高活性的產(chǎn)淀粉酶微生物。[4]利用淀粉平板透明圈法從自然環(huán)境中分離篩選淀粉酶生產(chǎn)菌，以淀粉指示劑進(jìn)行初步判斷，可以快速發(fā)現(xiàn)淀粉酶產(chǎn)生微生物，目前采用的淀粉顯色指示劑是碘液或者固體碘。碘液，組成成分是碘、碘化鉀和蒸餾水。碘液顯色劑需要自己配制并且保存時(shí)間短暫。固體碘利用碘升華法顯色，省去了碘液顯色法配制溶液的過程，然而不同產(chǎn)酶菌株，對(duì)于升華碘的用量、耐受時(shí)間及顯色時(shí)間具有差異，[5]并且不同的培養(yǎng)皿的密封程度差異，也會(huì)影響熏蒸過程顯色效果。

雖然淀粉酶產(chǎn)生菌篩選研究意義重大，但是淀粉酶活性初篩過程中的顯色劑有效期短暫、配制復(fù)雜、用量及顯色時(shí)間等問題制約了該領(lǐng)域的研究工作廣泛開展，特別是影響了本科生開設(shè)的“產(chǎn)淀粉酶菌株分離篩選實(shí)驗(yàn)”的成功率，本研究提供另外一種穩(wěn)定而使用方便的篩選指示劑，滿足快速準(zhǔn)確地篩選出產(chǎn)淀粉酶菌株要求。

1 材料與方法

1.1 材料

顯色劑：絡(luò)合碘購自藥店（生產(chǎn)廠家：上海利康消毒高科技有限公司）。

產(chǎn)淀粉酶菌株篩選培養(yǎng)基組成（w/v）：2% 可溶性淀粉，0.5% 蛋白胨，0.5% NaCl，0.05% MgSO4 7H2O，0.05% KH2PO4，1.5% 瓊脂，pH 7.0-7.2。

100mL小噴壺購自超市（生產(chǎn)廠家：滄縣華益塑料制品廠）。

1.2 方法與步驟

從自然環(huán)境（土壤和水體）中采集樣本，然后放置于滅菌塑料瓶中，立即帶回實(shí)驗(yàn)室，4℃保存，24h內(nèi)將采集的樣本進(jìn)行梯度稀釋，接種于含有淀粉酶產(chǎn)生菌篩選培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿里。設(shè)置26℃、30℃、38℃三個(gè)溫度不同培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-4天，培養(yǎng)皿上長出清晰可見的微生物菌落。

將30-50毫升絡(luò)合碘裝入塑料小噴壺，揭開培養(yǎng)皿上蓋，將絡(luò)合碘快速而均勻地噴霧到長出菌落的淀粉酶產(chǎn)生菌篩選培養(yǎng)基上，靜置2-4分鐘，觀察透明圈的形成，顯色時(shí)間不能太長（不超過4分鐘），以免碘揮發(fā)影響觀察[注：噴霧到淀粉酶產(chǎn)生菌篩選培養(yǎng)基的絡(luò)合碘體積為1-2毫升，靜置時(shí)間為2-4分鐘]。

挑取產(chǎn)生透明圈的菌落立即轉(zhuǎn)接至新的淀粉酶產(chǎn)生菌篩選培養(yǎng)基上，培養(yǎng)3-4天，再次顯色，用透明圈直徑/菌落直徑的比值，計(jì)算產(chǎn)酶活性[透明圈直徑/菌落直徑的比值大于1.7的菌落，為產(chǎn)酶活性高的菌落]。將產(chǎn)酶活性高的的菌落劃線培養(yǎng)獲取單菌落，同時(shí)檢測各個(gè)單菌落的淀粉酶產(chǎn)生情況，篩選產(chǎn)酶活性高的菌落。篩選得到的產(chǎn)酶活性高的淀粉酶產(chǎn)生菌，采用4℃試管斜面和-20℃甘油保存，以備后續(xù)研究。

2 結(jié)果

2013年6月，從三峽大學(xué)欣苑學(xué)生食堂附近采集土壤樣本和水體樣本，立即帶回實(shí)驗(yàn)室，樣本梯度稀釋后，涂布于淀粉酶產(chǎn)生菌篩選培養(yǎng)基上，培養(yǎng)3-4天，采用絡(luò)合碘顯色，可以清晰地顯示透明圈（圖 1）。

通過絡(luò)合碘顯色法，從4個(gè)不同樣品中獲得產(chǎn)淀粉酶微生物情況如表 1。

使用絡(luò)合碘顯色法，能夠從所有樣品中篩選獲得高活性產(chǎn)淀粉酶菌株。土壤A獲得的高活性產(chǎn)淀粉酶微生物為11個(gè)菌落，都屬于細(xì)菌。土壤B得到8個(gè)高活性菌落，均為細(xì)菌。土壤C得到5個(gè)高活性菌落，有一個(gè)屬于絲狀真菌。水體樣本獲得2個(gè)高活性細(xì)菌。本實(shí)驗(yàn)中沒有發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)溫度對(duì)產(chǎn)淀粉酶菌株篩選有影響，但是顯色時(shí)間不能太長，否則導(dǎo)致透明圈發(fā)生變化影響活性計(jì)算。其中土壤B樣品中獲得了透明圈直徑/菌落直徑的比值大于4.5的菌落，已經(jīng)對(duì)該菌落進(jìn)行了分離純化，繼續(xù)研究。endprint

通過絡(luò)合碘顯色法，只要拿到合適的樣本材料（通常從富含淀粉質(zhì)的環(huán)境采集），完全可以確保每個(gè)實(shí)驗(yàn)學(xué)生獲得理想的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，從而減少操作麻煩，提高實(shí)驗(yàn)效果，增強(qiáng)學(xué)生自信感。

3 討論

“產(chǎn)淀粉酶菌株分離篩選實(shí)驗(yàn)”作為微生物類綜合性實(shí)驗(yàn)，可以使學(xué)生熟悉專用培養(yǎng)基的配制，了解無菌操作的方法及其重要性，本實(shí)驗(yàn)的無菌操作往往被學(xué)生忽略，導(dǎo)致空氣中的雜菌污染，影響產(chǎn)淀粉酶菌株篩選成功幾率；學(xué)習(xí)稀釋涂布平板法和劃線平板法篩選分離目的微生物，掌握產(chǎn)淀粉酶菌株的篩選分離步驟，認(rèn)識(shí)產(chǎn)淀粉酶菌株的種類及其形態(tài)特征。通過本實(shí)驗(yàn)的成功與否，可以深化學(xué)生對(duì)于目的微生物篩選方法重要性認(rèn)識(shí)，同時(shí)促使學(xué)生了解不同功能微生物篩選樣品來源對(duì)于實(shí)驗(yàn)成敗的影響。[6]

“產(chǎn)淀粉酶菌株分離篩選實(shí)驗(yàn)”成敗受多種因素影響，其中顯示劑影響非常明顯。碘液中含有的碘是強(qiáng)還原劑，可以被空氣中氧氧化，改變碘的存在形態(tài)，并且碘易揮發(fā)，從而影響作為淀粉顯色劑的效果。固體碘熏蒸由于碘用量、毒性等原因，操作比較繁瑣而較少被采用。 商品化絡(luò)合碘使用方便，開瓶即可使用；保質(zhì)期長達(dá)12個(gè)月，顯示效果穩(wěn)定。

目前，本科階段開設(shè)的“產(chǎn)淀粉酶菌株分離篩選實(shí)驗(yàn)”均采用碘液進(jìn)行顯色，制約了產(chǎn)淀粉酶菌株選出幾率。

絡(luò)合碘采用表面活性劑如：聚醇醚、聚乙二醇、季胺鹽等作為碘載體和助溶劑，目前多數(shù)國家使用的PVP-I（聚乙烯吡咯烷酮碘，又稱聚維酮碘）為基本藥物的碘伏。高分子聚合物PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是最好的非離子表面活性劑，性質(zhì)穩(wěn)定、無毒、無臭、無味，并且具有很好的緩釋效應(yīng)。PVP憑借氫鍵與碘分子絡(luò)合，使得碘的腐蝕性下降，加之PVP的緩釋效果，絡(luò)合碘對(duì)產(chǎn)淀粉酶菌株傷害較小，可以直接將顯示水解圈的菌株轉(zhuǎn)接而獲得高活性產(chǎn)淀粉酶菌株。

4 結(jié)語

采用絡(luò)合碘噴霧的方式篩選產(chǎn)酶微生物，能方便、快捷地篩選產(chǎn)胞外淀粉酶菌株，替代碘液顯色法和固體碘熏蒸法推廣使用。

參考文獻(xiàn)

[1] 胡欣潔，鄧斌，胡承.微生物 淀粉酶的研究進(jìn)展[J].中國品牌與防偽，2005（9）.

[2] 李鵬，王健鑫，羅紅宇，戴秋萍.一株產(chǎn)淀粉酶海洋放線菌菌株的選育及發(fā)酵條件的研究[J].水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2014（38）.

[3] A. Pandey， P.Nigam，C.R. Soccol， V.T. Soccol， D. Singh， R. Mohan. Advances in microbial amylases[J].Biotechnology and Applied Biochemistry，2000（31）.

[4] 權(quán)淑靜，馬煥，劉德海，解復(fù)紅.青藏高原土壤產(chǎn)淀粉酶菌株的分離、鑒定及產(chǎn)酶特性研究[J].河南科學(xué)，2015（33）.

[5] 唐嘉，陳朝銀，趙聲蘭，夏靜，張濤.一種初篩產(chǎn)胞外淀粉酶菌株的簡化方法[J].生物加工過程，2008（6）.

[6] 戴亦軍，何偉，袁生，劉中華，賈永，張石柱.研究型模塊實(shí)驗(yàn)“產(chǎn)淀粉酶菌株的篩選、發(fā)酵條件優(yōu)化、菌種鑒定和選育”的教學(xué)實(shí)踐[J].微生物學(xué)通報(bào)，2017（44）.endprint