缺陷型基因組病毒的產(chǎn)生及作用

霍彩云，邢海云，唐玉玲，郭曉桐，楊光輝，李穎鑫，王書揚，胡艷欣

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，北京 海淀 100193； 2.中國奶業(yè)協(xié)會，北京 海淀 100193)

缺陷型基因組(DefectiveInterferingviruses，DI)病毒是指含有不完整的基因組片段的病毒粒子，這些病毒粒子可以有效地干擾完整具有感染性的子代病毒粒子的產(chǎn)生。DI病毒最早發(fā)現(xiàn)于流感病毒中，Von Magnus 在雞胚中增殖流感病毒時觀察到使用過高MOI的病毒接種，得到的新一代病毒的滴度反而下降[1]。近年來，由于其獨特的抗病毒功能，使缺陷病毒被越來越多的科學(xué)家關(guān)注，并且被作為疫苗佐劑廣泛的應(yīng)用于臨床中。本文從缺陷病毒的結(jié)構(gòu)、功能、檢測方法以及臨床應(yīng)用等方面加以綜述，以期為缺陷病毒在臨床中的應(yīng)用提供借鑒。

1 結(jié)構(gòu)

根據(jù)結(jié)構(gòu)特征，可將DI病毒分為缺失型和回折型這兩種類型：在單股負鏈RNA病毒中，缺失型DI病毒的產(chǎn)生是由于病毒聚合酶只在基因片段的前端發(fā)揮轉(zhuǎn)錄作用，或者聚合酶跳過了中間的部分直接到末端開始轉(zhuǎn)錄而缺失了基因片段的中間部分，因此親代基因3端和5端的含有啟動子的遺傳信息被保留，而含有關(guān)鍵基因的中間部分被刪除[2]?；卣坌虳I病毒具有1個環(huán)狀結(jié)構(gòu)，包含標準基因片段的10%～60%，并且含有標準基因片段不存在的互補末端序列。是其聚合酶在工作過程中脫離了模板，并利用已經(jīng)轉(zhuǎn)錄的片段作為模板繼續(xù)轉(zhuǎn)錄，這一過程就形成了互補的3端到5端片段?；卣坌陀址譃镃opy back 和Snap-back。Copy back 具有一個環(huán)狀的結(jié)構(gòu)而Snap-back 中互補的片段占據(jù)了差不多整個缺陷病毒的結(jié)構(gòu)[3-4]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，在PR8-H1N1感染的小鼠體內(nèi)和病人的上呼吸道組織中均發(fā)現(xiàn)了DI病毒的存在[5-6]。流感病毒屬于正黏病毒科，結(jié)構(gòu)中包含8個不同的單股負鏈基因組片段(PB1/PB2/HA/PA/NA/NP /NS/M)，基因組大小約為1 000～2 000個堿基對，共同編譯12～14種病毒蛋白，具有感染性的病毒粒子需要包含所有的基因片段，DI病毒含有至少一個缺失的基因片段，因此不具有感染性[7]。到目前為止，DI病毒產(chǎn)生的缺失多發(fā)生在PB2、PB1、PA這些編碼聚合酶的基因片段和M基因片段。Xue J. 等研究者在最新研究結(jié)果中表明H1N1流感毒株中存在HA缺失DI病毒，同時他們還證實了當流感病毒感染細胞時使用較高的感染復(fù)數(shù)或當感染時間增長時，會產(chǎn)生缺陷型病毒粒子，由于缺陷型流感病毒的結(jié)構(gòu)屬于中間部分缺失型，相對于完整的基因片段堿基對要少。因此當使用通用型引物進行PCR擴增病毒基因片段時會產(chǎn)生較小的產(chǎn)物，一般在300～600個堿基對間[8]。在H3N2亞型流感病毒感染小鼠肺組織中也可檢測到PB1、PB2、PA基因缺失的DI病毒[9]?？傊?，不同的流感病毒，產(chǎn)生缺陷型基因組的能力及其來源不盡相同，即使來自同一基因組片段，其基因序列也有可能不同。除流感病毒外，人們在彈狀病毒如水皰性口炎病毒(VSV)和狂犬病病毒(RV)、副黏病毒科中的仙臺病毒(SeV)、呼吸道合胞體病毒(RSV)和麻疹病毒(MV)，以及沙狀病毒科腦膜炎病毒(LCMV)中也發(fā)現(xiàn)了缺陷型病毒粒子的存在[10-17]。同時，在正鏈單股RNA病毒中，如脊髓灰質(zhì)炎病毒(PV)、甲肝病毒(HAV)、登革熱病毒(DENV)、西尼羅河病病毒(WNV)、艾滋病病毒HIV和丙肝病毒(HCV)中都會產(chǎn)生缺陷型病毒粒子[18-21]。

2 功能

DI病毒有兩大主要功能，包括干擾正常的完整的病毒的復(fù)制和刺激宿主的抗病毒免疫反應(yīng)。

2.1 干擾正常的完整的病毒的復(fù)制 當DI病毒與具有完整感染性的病毒共同培養(yǎng)時，DI病毒需要后者的輔助才能復(fù)制，但是由于結(jié)構(gòu)的縮短和其具有的高效的啟動子區(qū)域使得DI病毒更易于復(fù)制，當復(fù)制積累到一定程度以后，這些DI病毒能占據(jù)大部分的病毒聚合酶和與結(jié)構(gòu)蛋白競爭，從而直接干擾后者的復(fù)制[22]。近年來有研究證明，SeV、RSV、VSV、狂犬病病毒和流感病毒中含有的DI病毒粒子都分別能干擾正常完整結(jié)構(gòu)病毒的增殖，使正常病毒的復(fù)制降低[23-24]。Timo Frensing等研究者分析了流感病毒感染MDCK細胞后DI病毒對病毒復(fù)制的影響，發(fā)現(xiàn)PB2缺陷的DI病毒可干擾流感病毒的復(fù)制，并且其缺陷基因的RNA主要影響病毒復(fù)制的第二步-合成子代病毒粒子vRNA，從而影響細胞培養(yǎng)法生產(chǎn)疫苗的質(zhì)量[25]。

2.2 刺激宿主的抗病毒免疫反應(yīng) 大量研究表明，DI病毒能夠刺激感染后的細胞激活抗病毒反應(yīng)，產(chǎn)生干擾素，其中SeV的Cantell亞型是研究缺陷病毒相關(guān)干擾素反應(yīng)的金標準，被用于副黏病毒科病毒在體內(nèi)體外免疫刺激的研究[7，26-27]。DI病毒粒子能夠刺激模式識別受體，包括Toll likE-receptors (TLRs)、RIG-I like receptors (RLRs) 和melanoma differentiation-associated protein 5 (MDA5)[28-29]。當缺陷病毒被RLRs識別后，激活了下游的IRF3和NF-kB，繼而引起I型和III型干擾素、炎性細胞因子和干擾素刺激基因ISGs，如ISG54、 ISG56和 RSAD2的表達。當ISGs在被感染細胞內(nèi)抑制病毒時，干擾素又通過自分泌和旁分泌影響著周圍的細胞以及遠端組織的抗病毒反應(yīng)[30]。炎性細胞因子的表達，如 IL-6、TNF-α和 IL-1β，又促進著炎癥和先天性免疫到適應(yīng)性免疫的過渡。在流感病毒中，NS1蛋白為非結(jié)構(gòu)蛋白，是基因組片段中最短的，主要編碼NS1蛋白和NS2蛋白。NS2蛋白又稱核輸出蛋白，主要在感染晚期出現(xiàn)，存在于成熟病毒粒子中，參與核糖核蛋白復(fù)合物的核質(zhì)輸出，具有三大主要功能，包括其在感染早期，可與宿主模式識別受體中的RIG-1結(jié)合形成拮抗體，阻斷下游IRF信號通路，抑制干擾素的產(chǎn)生，是病毒在早期感染中逃避先天性免疫反應(yīng)的主要因素之一。Jihye Lee 等研究者在體外條件下KG11毒株會產(chǎn)生可表達分子量為13.2 kD的缺陷型NS1蛋白[31]。相比于全長型NS1蛋白，缺陷型NS1蛋白能夠刺激感染細胞激活抗病毒反應(yīng)，產(chǎn)生干擾素，從而干擾病毒的復(fù)制并使其毒力減弱。目前還有研究證明，缺失部分PB2基因后的缺陷病毒能夠編譯一個小分子蛋白，這個新生成的小分子蛋白能夠與抗病毒反應(yīng)信號通路上的MAVs作用，從而誘導(dǎo)I型干擾素反應(yīng)[32]。

3 檢測方法

對于DI病毒的檢測，對其定性時qPCR和基因序列的分析為常規(guī)、易操作的檢測方法。首先是通過瓊脂糖凝膠電泳觀察其病毒RNA或cDNA，緊接著測序來檢測DI病毒片段[8]。在對其進行定量時，主要采用的是實時熒光定量PCR法，該方法是利用熒光信號的變化實時檢測PCR擴增反應(yīng)中每一個循環(huán)擴增產(chǎn)物量的變化，通過Ct值和標準曲線的分析對起始模板進行定量分析，從而可計算得到模板拷貝值，但是也存在一定的缺點，例如其擴增效率具有引物依賴性、需要標準曲線等。為了克服這些缺陷，有學(xué)者建立了反轉(zhuǎn)錄微滴式數(shù)字PCR法(ddPCR)，它是一種用于檢測缺陷型干擾粒子的新方法[33]。ddPCR的原理是：在傳統(tǒng)PCR擴增前對樣品進行微滴化處理，即采用Bio-Rad QX200 ddPCR這個平臺，應(yīng)用微流體技術(shù)將含有核酸分子的反應(yīng)體系分成數(shù)萬個納米級的微滴，其中每個微滴或不含待檢核酸靶分子，或含1個至數(shù)個待檢核酸分子。經(jīng)PCR擴增后對每個微滴的熒光信號逐一分析，有熒光信號的微滴判讀為1，無熒光信號的微滴判讀為0，微流體設(shè)備中的掃描裝置可計算陽性和陰性微滴，并根據(jù)泊松分布原理及陽性微滴個數(shù)與比例即可精確得出靶分子的起始拷貝數(shù)或濃度。該方法克服了qPCR的一些缺陷，比如不依賴于擴增曲線的循環(huán)閾值(Ct)、不受擴增效率影響和不需標準曲線等，具有良好的準確性和重現(xiàn)性。Samantha L. Schwartz等研究者在檢測缺陷流感病毒時就通過對這兩種方法的比較來進一步證實了ddPCR法的優(yōu)勢[33]。相比于qPCR法僅限于進行不同病毒間相同DI病毒片段的比較，ddPCR檢測法不僅可進行不同病毒間相同DI病毒片段的比較，也可進行同一病毒間不同DI病毒片段的比較。該研究認為ddPCR檢測法具有高度的靈敏性和較低的變異系數(shù)，可精確測定每個樣品中模板的拷貝值，實現(xiàn)真正意義上的絕對熒光定量，有利于實現(xiàn)對缺陷病毒的精確測定以及毒株的質(zhì)量化控制。

4 DI病毒的抗病毒臨床應(yīng)用

DI病毒由于其不具感染性和激活宿主細胞免疫反應(yīng)的能力，吸引了大量科研工作者對其臨床抗病毒功能進行了研究。DI 病毒對VSV和猿猴空泡病毒SFV感染小鼠均有一定的保護作用，而這種保護作用可能與I型干擾素的分泌有關(guān)。大量的研究證實在小鼠感染A型流感病毒后，如果其中含有高濃度的缺陷病毒，小鼠體內(nèi)病毒的含量以及免疫損傷都有所降低[34]。最新研究表明，通過反向遺傳學(xué)技術(shù)重組PR8-H1N1 DI病毒在體內(nèi)體外均有良好的抗病毒效果，并且還對B型流感病毒感染具有交叉免疫保護作用。其中，244 DI病毒在致死性流感病毒感染小鼠中具有良好的保護作用。該DI病毒來源于流感病毒的PB1片段，通過反向遺傳技術(shù)嵌入到A/PR/8/34流感病毒而得到[35]。在對小鼠滴鼻注射H1N1/H2N2/H3N2或H3N8病毒前或同時間滴鼻給予244 DI病毒，能夠顯著減輕感染小鼠的臨床癥狀，并且該244 DI病毒對于感染后的治療也具有明顯的效果。244/PR8不具有毒性并且不會產(chǎn)生臨床副作用，其注射過程也不會具有感染性。注射244/PR8病毒會對不同品系、不同年齡階段的小鼠均產(chǎn)生保護作用。通過對患有嚴重聯(lián)合免疫缺陷病小鼠的感染研究，證實了獲得性免疫應(yīng)答雖然不能起到保護作用但是能夠有效的清除病毒。DI病毒能夠促使干擾素聚集在呼吸道，能夠?qū)Ξ愒葱院粑啦《救鏐型流感病毒、副黏病毒、肺炎病毒等感染的小鼠提供保護作用，因此DI病毒可作為抗流感治療的潛在的有效的新途徑[36]。由于DI病毒的生物學(xué)特性，使用蔗糖密度離心法也成為分離DI病毒的一種方法，例如缺陷型水泡性口炎病毒。水泡性口炎病毒屬于彈狀病毒，通過其基因組大小的不同可將其DI病毒從完整型病毒中分離出來[37]。對于脊髓灰質(zhì)炎病毒或呼腸孤病毒，DI病毒和標準病毒粒子的生物學(xué)特性差異很小，因此需要更為靈敏的方法才能檢測到DI病毒，例如脊髓灰質(zhì)炎病毒和其DI病毒可通過氯化銫梯度離心法分離出[37]。雖然這種方法較為容易的分離出純DI病毒，但是并不適用于所有類型的病毒，例如流感病毒。由于流感病毒的DI病毒和完整型病毒的尺寸大小差異很小，故蔗糖密度離心法不能有效的進行分離，因此研究者在分離缺陷流感病毒的過程中更多采用的是反向遺傳技術(shù)[38]。

5 總結(jié)與展望

DI病毒在許多病毒中的廣泛出現(xiàn)證實了它們在動物病毒生物學(xué)方面的重要性，它們核苷酸的缺失以及干擾素活性可在病毒生長調(diào)控方面具有重要的作用。通過細胞培養(yǎng)的生物化學(xué)研究和實驗動物的生物學(xué)研究認為，DI病毒對疾病可產(chǎn)生良好的預(yù)防和控制效果，特別是人獸共患病，比如A型流感病毒。目前，防控禽流感的方法主要為抗流感藥物的使用和疫苗接種。然而，疫苗接種存在一定的局限性，雖然在實踐中應(yīng)用了一些已研發(fā)出的疫苗，但是流感病毒所具有的抗原漂移和抗原變異的特點使其毒株不斷地變化，從而使疫苗不能有效的對抗其發(fā)生變異的毒株。因此，探尋新的抗病毒方法迫在眉睫。DI病毒的良好的抗病毒效果使其成為潛在的免疫佐劑用于疾病中。未來，隨著DI病毒的不斷深入研究，使其可以應(yīng)用的更多的疾病防控中，具有廣闊的應(yīng)用和發(fā)展前景。