企鵝煙曲霉病的診斷

王玉田，朱華民2，金銀姬，劉 鑫，李志衍,趙 有，潘興亮，劉艷華，鄭瑞峰

(1.北京市畜牧總站，北京朝陽100107 ； 2.北京市房山區(qū)琉璃河動物防疫站，北京房山102431，3.北京科為博生物科技有限公司，北京朝陽100850)

2017年2月, 某海洋館已飼養(yǎng)17年的洪氏環(huán)企鵝死亡，從2016年8月發(fā)現(xiàn)換毛遲緩，逐漸消瘦。 2個星期前發(fā)現(xiàn)哮喘，呼吸困難?？诜嗝顾?、鏈霉素等抗生素治療無效，剖檢腹腔、氣囊、肺臟上有1～10 mm黃白色、干酪樣結(jié)節(jié)。腫瘤、結(jié)核或是霉菌不能確定，來我單位診斷，希望確診。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 剖開皮膚，機(jī)體消瘦，肺臟、氣囊內(nèi)有大小不等黃白色結(jié)節(jié)(見中插彩版圖1、圖2)，無菌采集肺臟上的增生結(jié)節(jié)組織。

1.2 試驗方法

(1)病理組織血檢驗：增生結(jié)節(jié)10%福爾馬林固定，經(jīng)石蠟切片、H.E.染色、抗酸染色、PASM染色顯微鏡鏡檢。

(2)細(xì)菌病原檢測：結(jié)節(jié)組織外部灼燒滅菌, 組織切面涂新鮮血液、巧克力瓊脂培養(yǎng)基、馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)；鏡檢，觀察細(xì)菌形態(tài)，多次分離純化，得到純化細(xì)菌(圖3、圖4)。取分離到真菌的DNA作為模板，用真菌菌種鑒定通用引物

(NS1 -GTAGTCATATGCTTGTCTC;NS6-GCAT

CACAGACCTGTTATTGCCTC )進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，產(chǎn)物送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測序。測序結(jié)果提交GenBank，并與其他真菌進(jìn)行比對，確定18S rDNA 基因型。

2 結(jié)果

2.1 病理組織學(xué)變化 病理性結(jié)節(jié)中心干酪性壞死，出現(xiàn)大量浪漢斯巨細(xì)胞，具有典型的感染性肉芽腫特征。H.E.染色發(fā)現(xiàn)無色透明的絲狀菌絲結(jié)構(gòu)，六胺銀染色(PASM)方法染色可見黑褐色曲霉(圖5)，呈典型的曲霉菌絲特征，菌絲細(xì)長有隔，粗細(xì)均勻，從結(jié)節(jié)中心向外周組織放射狀排列(圖6)；抗酸染色未見陽性分支桿菌。

2.2 細(xì)菌病原分離、鑒定 經(jīng)多次分離培養(yǎng)，僅在馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基上菌落生長塊，棉花樣，開始為白色，2～3 d轉(zhuǎn)為綠色，數(shù)日后變?yōu)樯罹G色，呈粉末狀。根據(jù)真菌18S rDNA序列差異性分析，確定該菌株18S rDNA 序列(GenBank 登錄號為 KR019681.1)為煙曲霉。

測序獲得的基因序列：

TATACGGTGAAACTGCGAATGGCTCATTAAATCAGTTATCGTTTATCCTGATAGTACCTTACTACATGGATACCTG

TGGTAATTCTAGAGCTAATACATGCTAAAAACCTCGACTTCGGAAGGGGTGTATTTATTAGATAAAAAACCAATG

CCCTTCGGGGCTCCTTGGTGAATCATAATAACTTAACGAATCGCATGGCCTTGCGCCGGCGATGGTTCATTCAAAT

TTCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTAGGATAGTGGCCTACCATGGTGGCAACGGGTAACGGGGAATTAGGGTTCG

ATTCCGGAGAGGGAGCCTGAGAAACGGCTACCACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATCCCG

ACACGGGGAGGTAGTGACAATAAATACTGATACGGGGCTCTTTTGGGTCTCGTAATTGGAATGAGTACAATCTAA

ATCCCTTAACGAGGAACAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATA

TTAAAGTTGTTGCAGTTAAAAAGCTCGTAGTTGAACCTTGGGTCTGGCTGGCCGGTCCGCCTCACCGCGAGTACTG

GTCCGGCTGGACCTTTCCTTCTGGGGAACCTCATGGCCTTCACTGGCTGTGGGGGGAACCAGGACTTTTACTGTGA

AAAAATTAGAGTGTTCAAAGCAGGCCTTTGCTCGAATACATTAGCATGGAATAATAGAATAGGACGTGCGGTTCT

ATTTTGTTGGTTTCTAGGACCGCCGTAATGATTAATAGGGATAGTCGGGGGCGTCAGTATTCAGCTGTCAGAGGTG