石蠟包埋組織在分子生物學實驗中的研究進展

嚴曉麗 杜夢楠 鄭紀寧

(承德醫(yī)學院，河北 承德 067000)

甲醛固定石蠟包埋是臨床病理組織最常規(guī)的儲存方式，臨床石蠟標本包含有豐富的臨床信息和病理資料，是進行人類疾病研究非常寶貴的資源。但是由于組織在甲醛固定和石蠟包埋加工過程中引起RNA和蛋白交聯(lián)及共價修飾等作用，以至提取的RNA質量較差，使得石蠟組織并未在實驗研究中得到廣泛的應用。而microRNAs(miRNAs)是一種分子鏈較短且具有調控作用的小分子RNA，可抵抗組織固定和包埋過程對分子結構造成的影響，在加工處理過程中其分子結構和化學性質仍可保持穩(wěn)定，且目前已經證實miRNAs在多種疾病包括腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著非常重要的作用。因此通過對石蠟組織中miRNAs表達的分析研究，可充分發(fā)揮石蠟包埋組織在分子生物學實驗研究中的作用，尤其對人類疾病的回顧性研究和一些罕見疾病研究做出更多貢獻。

1 石蠟包埋組織的價值

基因表達譜可為臨床診斷、預后判斷、指導臨床靶向用藥及人類腫瘤的分類尤其是起源不明的轉移性腫瘤分類等多個方面提供預測信息〔1，2〕，其中完整RNA的提取是檢測基因表達譜的前提。新鮮冰凍組織是提取完整RNA最可靠的來源，但是由于新鮮組織的獲取和保存都比較困難，因此限制了一些實驗技術在實驗研究中更廣泛的應用及普及。而甲醛固定石蠟包埋(FFPE)是現(xiàn)階段臨床病理組織最常用的儲存形式，組織病理學歸檔的石蠟組織具有完備的病理資料和臨床信息，且在實驗研究中容易獲得，對人類疾病的回顧性研究和新的分子生物標志物的發(fā)現(xiàn)非常有價值。

2 石蠟包埋組織在實驗研究的局限性

隨著高含量、高通量分子生物技術如定量逆轉錄-聚合酶鏈式反應(qRT-PCR)、分子克隆和芯片技術等的出現(xiàn)，歸檔的FFPE組織中所包含的生物數(shù)據(jù)信息越來越受到研究者的關注，這些病理標本對于基礎和臨床方面研究的作用和價值也已得到確認，但并未在分子基因表達研究中得到廣泛應用。因為甲醛固定雖有助于組織分子結構和細胞蛋白的保存，但因組織在甲醛固定、石蠟包埋過程中會發(fā)生甲醛誘導的核酸與蛋白質交聯(lián)、共價修飾核酸堿基作用，且在固定前和固定過程中可出現(xiàn)酶解和化學降解等現(xiàn)象及推遲固定和延長固定時間等因素，都會影響核酸的萃取效率及質量與穩(wěn)定性，從而限制了石蠟組織標本在分子生物實驗中的應用〔3～5〕。因此，從FFPE組織中提取完整的、高純度的RNA極具挑戰(zhàn)性〔6，7〕。

近年來，許多研究小組試圖突破石蠟組織在分子生物實驗研究應用中的局限〔8～10〕。Moelans等〔11,12〕采用多種分子病理實驗技術(逆轉錄定量PCR、免疫蛋白印跡、微衛(wèi)星不穩(wěn)定、熒光原位雜交等)測試對比3種新型且毒性更低的固定液(含酒精的非交聯(lián)固定液FineFIX、RCL2與交聯(lián)固定液F-Solv)和傳統(tǒng)的中性甲醛(NBF)固定液的總體固定效果，發(fā)現(xiàn)從RNA的萃取效率、純度及完整性方面看，新型固定液效果看似更好。但從組織形態(tài)學、蛋白質提取及免疫組織化學等效果綜合評估看，這3種新型固定液的固定效果次于NBF。比較還發(fā)現(xiàn)由F-Solv與FineFIX固定的組織硬度較大，由RCL2固定的組織較軟而滑，這些均不利于組織切片，對常規(guī)病理診斷帶來不便。此外，綜合考慮特殊組織如淋巴結的固定、組織固定過程中引起不同程度的收縮、色素沉著及細胞脫顆粒與溶解等因素，最終得出這3種新型固定液對組織的固定效果均次于甲醛，因此，尚不能替代NBF用于臨床活檢組織與手術標本的固定。

另外，多項研究表明從FFPE 組織中提取的總RNA 片段長度不超過300 bp〔12,13〕。Doleshal等〔14〕通過比較從不同器官石蠟組織和相應的冰凍組織中提取的RNA質量發(fā)現(xiàn)，新鮮冰凍組織中提取的RNA質量較好，有明顯且清楚的18S和28S rRNA條帶，而從石蠟組織中提取的RNA平均分子量低于100個核苷酸，組織標本在加工過程中的處理條件如時間、溫度及石蠟組織存放的年限都會對RNA的完整性產生明顯影響。Cronin等〔13〕從保存不同年限的乳腺癌石蠟包埋組織中提取RNA并分析了其片段大小，發(fā)現(xiàn)保存1年的石蠟組織較保存1～17年的石蠟組織中RNA有更大的平均分子量。以上均說明從石蠟組織中提取的RNA質量較差，因而使石蠟組織未能在分子生物實驗研究中得到廣泛應用。近年研究發(fā)現(xiàn)，如原位雜交、Northern雜交等可用于FFPE組織中基因表達的檢測研究〔15～18〕，但這些方法并不適合高含量、高通量分子的分析，因此在實驗研究中尚不能代替qRT-PCR方法。因此，目前既未有更新的分子檢測技術被開發(fā)，也沒有能提高石蠟組織中核酸質量和完整性恢復的新固定方法被發(fā)現(xiàn)，這些技術工藝的不足限制了石蠟包埋組織在疾病分子研究及基因表達分析研究中的應用。隨著基因組研究的不斷深入，近年有關miRNAs的研究越來越受到研究者的關注，新的miRNAs不斷被發(fā)現(xiàn)，但其具體的作用機制及其上下游的調控基因都還不清楚。

3 miRNA的介紹及在石蠟包埋組織中的研究

miRNAs是一種長度18～25個核苷酸的非編碼小分子RNA，具有在轉錄后水平調控基因表達的功能。與mRNA不同，mRNA必須翻譯成蛋白質才能發(fā)揮一定的生物作用，而miRNAs的表達水平與其基因的功能有更密切關系。且miRNAs的化學性質相較于mRNA更穩(wěn)定〔19,20〕。miRNAs具有多種特性，通過對石蠟包埋組織中miRNAs表達的研究，這些牧場生使得石蠟組織標本成為研究基因表達譜的可靠資源。miRNAs特性之一是miRNAs位于基因序列的上游調節(jié)區(qū)。成熟的miRNA可與誘導沉默復合物(RISC)結合形成RISC復合體，RISC復合體特異性識別靶mRNA的3′-非編碼區(qū)(UTR)，通過與靶mRNA的3′-UTR堿基互補配對實現(xiàn)降解靶mRNA或抑制靶mRNA的翻譯，進而調控靶基因的表達〔21〕。已有大量研究報道m(xù)iRNAs在細胞增殖、分化、凋亡、腫瘤形成及化療耐藥等多個生物過程中發(fā)揮重要作用〔22,23〕。另外，基因組研究表明，單個的miRNA可以調節(jié)數(shù)百個靶mRNA〔24〕。因此，miRNA很可能成為臨床上診斷疾病、判斷預后的生物標志物及治療靶點。第二，miRNAs的分子結構和化學性質在石蠟組織中仍保存良好。因為miRNAs分子鏈很短，其分子結構幾乎不受甲醛固定、石蠟包埋操作過程的影響，從而可對抗組織在加工處理過程中引起的RNA分子鏈斷裂、RNA與蛋白質交聯(lián)及化學修飾等影響。目前已有多項研究〔25,26〕表明，miRNAs在石蠟包埋組織中性質穩(wěn)定，通過qRT-PCR方法比較mRNA與miRNAs在石蠟包埋組織和新鮮冰凍組織中表達水平的差異發(fā)現(xiàn)，mRNA由于分子鏈長、蛋白酶降解與化學修飾等原因使其表達水平在兩類組織中的相關性較弱，而通過對石蠟包埋組織和新鮮冰凍組織中miRNAs的表達水平進行分析發(fā)現(xiàn)，這兩類組織中miRNAs的表達水平有明顯相關性，且miRNAs表達水平的多少與甲醛固定時間及石蠟組織儲存時間無密切關系，說明miRNAs的化學性質在石蠟組織中較mRNA保持更穩(wěn)定。第三，miRNAs作為分子標志物可通過多種分子生物學實驗方法被檢測出。miRNAs在組織細胞內的含量較低，這對于其檢測是一個挑戰(zhàn)。而qRT-PCR技術有特異性強、靈敏度高等優(yōu)點，可對組織細胞內表達量較低的目的基因進行檢測。另外，已有多項研究〔27,28〕已通過芯片技術對石蠟組織中的miRNAs表達水平進行分析，所得結論與qRT-PCR結果相一致，進一步說明miRNAs在石蠟組織中保持有較好的穩(wěn)定性。第四，miRNAs還可能受RISC復合物的保護而免受可引起RNA降解的因素帶來的影響〔29〕。因此，病理資料齊全、臨床信息完善的石蠟包埋組織作為一個現(xiàn)成的資源，在進行miRNAs表達分析的研究中是非常寶貴和理想的實驗材料。

由此猜想，細胞株在經過甲醛固定石蠟包埋處理后其石蠟細胞塊中miRNAs的穩(wěn)定性是否仍可保持良好，如果可以，那體液如胸、腹水等含有的細胞也可做成石蠟細胞塊儲存并進行下一步的實驗與研究，這將為臨床病理的分子生物實驗提供一種新的實驗材料和資源。Li等〔29〕以快速冰凍的細胞與甲醛固定石蠟包埋細胞塊為材料對比分析兩類細胞中miRNAs表達水平的變化，結果顯示在兩類細胞中提取總RNA量相同的情況下，石蠟包埋細胞塊的總RNA中包含的miRNAs量更多，大約是新鮮冰凍組織中所包含的2倍，原因可能是產生等量的總RNA所需的石蠟包埋細胞數(shù)較新鮮冰凍細胞數(shù)更多，這很可能也是由于在固定和包埋過程中引起細胞塊的RNA和蛋白間的甲基化交聯(lián)與共價修飾等因素導致提取的總RNA量減少，而miRNAs幾乎不受這些作用的影響。多項實驗研究證明miRNAs的表達水平在保存10年的石蠟組織中還保持相對穩(wěn)定〔26,30〕?？傊?，石蠟組織中miRNAs的分子結構和化學性質比較穩(wěn)定，其表達水平與新鮮冰凍組織相比較幾乎沒有明顯變化，有望成為分子病理檢測的一個新靶點。另外，還有研究發(fā)現(xiàn)miRNAs參與了各器官的發(fā)展，在不同組織中miRNAs的表達存在差異，表現(xiàn)出明顯的組織特異性〔31～33〕，因此miRNAs還有助于判斷起源不明的轉移性腫瘤的組織來源。

綜上，mRNA在甲醛固定石蠟包埋過程中可能會發(fā)生交聯(lián)反應和共價修飾，從而導致石蠟組織中總RNA的萃取效率和質量下降，因而限制了具有豐富病理資料和臨床信息的石蠟組織標本在分子生物學實驗研究中的應用。但miRNAs由于分子量短，其分子結構和化學性質幾乎不受固定與包埋過程的影響，因此在臨床歸檔的石蠟包埋組織中，miRNAs表達相對于mRNA更穩(wěn)定和準確。miRNAs在細胞增殖、分化、凋亡和腫瘤形成的多個過程中發(fā)揮重要作用，但目前miRNAs在這些生物過程中詳細的分子調控機制及其上下游的調控基因尚未完全闡明，因此，隨著對miRNAs研究的不斷深入及實驗技術的不斷成熟，通過對石蠟包埋組織中miRNAs表達量的分析，miRNAs有可能成為一種新的臨床診斷、預后判斷、反映治療效果、指導臨床用藥的新的分子生物標志物。同時，石蠟組織標本在基礎、臨床及人類疾病回顧性研究和一些罕見疾病的分析等方面也將會有更廣闊的應用前景。