多菌混合發(fā)酵對(duì)醬油的風(fēng)味物質(zhì)形成及感官指標(biāo)的影響

方冠宇 姜佳麗 蔣予箭

（浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院 杭州 310018）

醬油是以大豆（或豆粕）、小麥（或麩皮）為主要原料[1]，以米曲霉制曲，加食鹽發(fā)酵而成的一種調(diào)味品。早期，醬油生產(chǎn)以天然混菌發(fā)酵為主。上世紀(jì)60～70年代，為了提高氨態(tài)氮得率等指標(biāo)，逐步過渡到米曲霉純種發(fā)酵。上世紀(jì)末，醬油企業(yè)為了改善醬油的風(fēng)味，又紛紛嘗試添加魯氏酵母菌、球擬酵母和乳酸菌發(fā)酵來(lái)提高醬油品質(zhì)。

以米曲霉制曲發(fā)酵醬油，導(dǎo)致醬油口味過于單調(diào)，原料利用率不高[2]。傳統(tǒng)的單菌種醬油釀造方法生產(chǎn)的醬油香味主要為醬香型。有研究表明，多菌種發(fā)酵，能改善醬油發(fā)酵過程中的酶系，改善醬油風(fēng)味并且提高原料利用率[3]。用多菌種發(fā)酵高鹽稀態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)的醬油其特征性風(fēng)味物質(zhì)含量上會(huì)增加很多，在香味上有很大的改善，大大提高了醬油的品質(zhì)[4-5]。一般是在醬油發(fā)酵過程中人工添加耐鹽酵母菌和乳酸菌來(lái)提高醬油的品質(zhì)[6-8]。乳酸菌產(chǎn)生的酸味，會(huì)使醬油的咸味更加柔和，使醬油有更好的口感[9]。本文通過添加不同種類的菌種進(jìn)行高鹽稀態(tài)醬油發(fā)酵方法，來(lái)研究醬油中的理化指標(biāo)與風(fēng)味物質(zhì)的不同。再用適當(dāng)?shù)暮瘮?shù)，擬合出不同菌種發(fā)酵的醬油發(fā)酵過程中理化指標(biāo)與發(fā)酵時(shí)間的關(guān)系，以及特征性風(fēng)味物質(zhì)含量與發(fā)酵時(shí)間之間的關(guān)系，探索多菌種參與發(fā)酵的醬油的最佳發(fā)酵周期。以及對(duì)醬油進(jìn)行食品感官定量分析，多角度考察多菌種不同組合方式對(duì)醬油的口感與風(fēng)味的影響。這將對(duì)醬油的實(shí)際生產(chǎn)有很大意義。

1 材料與設(shè)備

1.1 材料與試劑

豆粕、麩皮、AS3.042米曲霉，老恒河釀造有限公司；AS2.180魯氏酵母、滬釀2.14球擬酵母、滬釀1.08乳酸菌，上海迪發(fā)有限公司；氫氧化鈉，天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心；濃鹽酸（36%～38%），衢州恒化試劑有限公司；濃硫酸，衢州恒化試劑有限公司；葡萄糖，廣東光華化學(xué)廠有限公司；硫酸鉀，上海振新試劑廠；乙酸、3-甲基丁醛、丁醇、乙酸乙酯、3-辛醇（內(nèi)標(biāo)），Alfa aecer公司；甲醛（36%），杭州高晶精細(xì)化工有限公司；氯化鈉，天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心。

1.2 儀器與設(shè)備

HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋，上海博迅；8HW-1型恒溫磁力攪拌器，科大創(chuàng)新；pHS-3C型酸度計(jì)，上海雷磁儀器廠；電子天平，上海精科；電子分析天平，上海精科；721可見分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；TN303-4恒溫培養(yǎng)箱，南京市江寧電器儀器廠；3-Octanol（內(nèi)標(biāo)），Alfa aecer公司；30 m×0.25 mm×0.25 μm 毛細(xì)管色譜柱；75 μm Carboxen/PDMS萃取頭；Agilient 5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國(guó)安捷倫公司；手動(dòng)SPME進(jìn)樣器。

1.3 方法

1.3.1 制曲 以6∶4（w/w）的比例把原料豆粕與麩皮均勻混合。然后經(jīng)過潤(rùn)水、蒸煮、冷卻三個(gè)步驟后，按接種量為0.3%接種滬釀3.042米曲霉單菌種制曲。在35～37℃下，制曲46 h[10-11]。

1.3.2 醬油發(fā)酵 設(shè)置4個(gè)組，Ⅰ組為對(duì)照組，其余Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ 3組為試驗(yàn)組。每組稱取成曲10 kg，然后與濃度為19°Bé的鹽水按照1∶2（曲∶鹽水w/w）的比例混合[12]，進(jìn)行發(fā)酵，溫度為室溫。按照表1的試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行試驗(yàn)。發(fā)酵開始的當(dāng)天設(shè)為0 d開始取樣，之后每隔10 d取樣一次，測(cè)定在不同時(shí)間段醬油發(fā)酵過程中理化指標(biāo)的變化。到90 d結(jié)束取樣。

表1 多菌種發(fā)酵的試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Experimental design of multi-strain fermentation

1.3.3 理化指標(biāo)測(cè)定 氨基酸態(tài)氮測(cè)定：甲醛滴定法；糖化酶測(cè)定：硫代硫酸鈉滴定法[13]；pH測(cè)定：pH計(jì)直接滴定法；還原糖測(cè)定：菲林試劑滴定法[14]。

1.3.4 風(fēng)味物質(zhì)測(cè)定

1.3.4.1 HS-SPME-GC/MS方法 SPME萃取條件：固相微萃取技術(shù)可以在一定程度上檢測(cè)出醬油中的可揮發(fā)性成分和相對(duì)含量[15]。準(zhǔn)確移取5.00 mL樣品、2 μL 0.1 g/L內(nèi)標(biāo)物3-辛醇、一定量的NaCl于萃取瓶中，放在50℃水浴中保持10 min。萃取溫度50℃，頂空吸附40 min。

GC條件：色譜柱：DB-1701毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；升溫程序：起始溫度 40℃，保持 10 min，以 3℃/min升至 100℃，再以 4℃/min上升至180℃，最后以6℃/min上升至220℃；進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣；載氣：氦氣，流速1.0 mL/min；進(jìn)樣口溫度：250℃。

MS條件：電離方式：EI，電子能量70 eV；離子源溫度：230℃；MS接口溫度：220℃；掃描質(zhì)量范圍：33～450 amu。

1.3.4.2 分析方法 由Xcalibur軟件對(duì)照NIST 05庫(kù)進(jìn)行數(shù)據(jù)收集，譜庫(kù)初步鑒定物質(zhì)成分，結(jié)合保留時(shí)間、質(zhì)譜、試劑成分和保留指數(shù)定性。面積歸一化法相對(duì)定量。

1.3.4.3 定量方法 選3-辛醇作為內(nèi)標(biāo)物，測(cè)定醬油中的乙酸、3-甲基丁醛、丁醇、乙酸乙酯對(duì)3-辛醇的相應(yīng)響應(yīng)因子。羰基化合物與雜環(huán)類化合物以醛類響應(yīng)因子計(jì)算。

相對(duì)質(zhì)量校正因子計(jì)算：

Fi=As× mi/（Ai× ms）

式中：As與Ai——分別為標(biāo)品i和內(nèi)標(biāo)物s的峰面積；mi與ms——分別為標(biāo)品i和內(nèi)標(biāo)物s的含量。

風(fēng)味物質(zhì)含量計(jì)算公式：

Wi=Fi× Ai× Ws/As

式中：Wi，Ws——分別為組分i與內(nèi)標(biāo)物s的含量；Ai，As——分別為組分i與內(nèi)標(biāo)物s的峰面積；Fi——各物質(zhì)相對(duì)質(zhì)量校正因子。

1.3.5 醬油的感官鑒定 參考醬油的感官評(píng)定方法及規(guī)則[16]，對(duì)醬油的感官指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)。各項(xiàng)指標(biāo)的滿分為12分，各項(xiàng)指標(biāo)處于最佳狀態(tài)時(shí)為滿分，其他情況相應(yīng)扣分。

2 結(jié)果與討論

2.1 醬油中的理化指標(biāo)分析

對(duì)醬油中的氨基酸態(tài)氮含量、糖化酶含量、pH值、還原糖含量與發(fā)酵天數(shù)的關(guān)系用Origin 8軟件進(jìn)行擬合，可以得到醬油的理化指標(biāo)與發(fā)酵時(shí)間的函數(shù)。醬油的pH等理化指標(biāo)與發(fā)酵時(shí)間的擬合曲線見圖1～圖3。

圖1 發(fā)酵過程中氨基酸態(tài)氮含量的變化Fig.1 The variety of ammoniacal nitrogen content in the process of fermentation

由圖1可知，發(fā)酵90 d，Ⅳ組添加了魯氏酵母、球擬酵母和乳酸菌制曲的醬油氨基酸態(tài)氮含量最高，可達(dá)到1.38 g/100 mL，Ⅰ組最低。在發(fā)酵過程中氨基酸態(tài)氮的含量趨勢(shì)呈現(xiàn)先增加后平穩(wěn)。在50 d以前，對(duì)照組高于試驗(yàn)組，50 d后對(duì)照組中的氨基酸態(tài)氮含量基本趨于平穩(wěn)。而試驗(yàn)組中的氨基酸態(tài)氮在前60 d一直保持上升趨勢(shì)，直至60 d時(shí)才趨于平穩(wěn)。這是由于添加魯氏酵母與球擬酵母后，在前期酵母大量繁殖，消耗較多氨基酸。因此在30～50 d時(shí)，試驗(yàn)組中的氨基酸態(tài)氮低于對(duì)照組。而50 d后，由于對(duì)照組中的氨基酸與糖類發(fā)生美拉德反應(yīng)消耗氨基酸，而試驗(yàn)組中的這一過程發(fā)生在60 d后。

由圖2可知，pH呈現(xiàn)出不斷下降的趨勢(shì)，這是由于在發(fā)酵過程中，由于醬油中有機(jī)酸的不斷產(chǎn)生。明顯可以看出，pH下降最快的為Ⅳ組。這是由于Ⅳ組添加了乳酸菌，乳酸菌可以利用糖類、檸檬酸生成乳酸和醋酸，從而產(chǎn)生以上現(xiàn)象。并且pH下降至5附近，抑制了非耐酸雜菌的生長(zhǎng)，同時(shí)促進(jìn)酵母的繁殖與發(fā)酵。另外，酸性物質(zhì)賦予了醬油爽適的風(fēng)味，改善醬油的口感。并且酸性物質(zhì)的生成抑制了非耐酸微生物的繁殖，但可以促進(jìn)醬油酵母的生長(zhǎng)與繁殖，以及酒精發(fā)酵。

圖2 發(fā)酵過程中pH的變化Fig.2 The variety of pH in the process of fermentation

圖3 發(fā)酵過程中還原糖含量的變化Fig.3 The variety of reducing sugar content in the process of fermentation

由圖3可知，在發(fā)酵過程中，還原糖的含量呈現(xiàn)先增加后減少的現(xiàn)象。這是由于制曲時(shí)積累的淀粉酶作用下，還原糖含量上升，和可利用多糖的釋放[17]。而后期，由于美拉德反應(yīng)以及微生物代謝消耗還原糖，導(dǎo)致還原糖含量下降[18-19]。

2.2 醬油中的風(fēng)味物質(zhì)分析

用HS-SPME-GC/MS方法對(duì)發(fā)酵完成時(shí)的醬油中揮發(fā)性成分進(jìn)行測(cè)定。根據(jù)各組分的峰面積Ai和校正因子Fi對(duì)各揮發(fā)性成分的含量進(jìn)行計(jì)算。其結(jié)果見表2。

表2 多菌種高鹽稀態(tài)醬油發(fā)酵完成時(shí)揮發(fā)性成分比較（μg/L）Table 2 Volatile components of high-salt diluted-state muti-strain fermentation soy sauce of the finished fermentation（μg/L）

（續(xù)表2）

由表可知，只以米曲霉制曲發(fā)酵的醬油測(cè)到的揮發(fā)性成分為41種；添加了魯氏酵母發(fā)酵的醬油測(cè)到揮發(fā)性成分為51種；添加魯氏酵母和球擬酵母發(fā)酵的醬油測(cè)到揮發(fā)性成分為55種；添加了魯氏酵母、球擬酵母和乳酸菌發(fā)酵的醬油測(cè)到揮發(fā)性成分為58種?？梢缘贸?，隨著醬油發(fā)酵菌種種類的增加，其醬油中的揮發(fā)性成分的種類也越多。這是由于醋醅中添加了酵母菌和乳酸菌發(fā)酵，微生物的代謝活動(dòng)增加。由微生物代謝產(chǎn)生的醇類、酸類等代謝產(chǎn)物增加，并且這些代謝產(chǎn)物互相反應(yīng)，生成酯類等揮發(fā)性成分。因此利用多菌進(jìn)行發(fā)酵，可以增加醬油的風(fēng)味，提高醬油的品質(zhì)。

分別取經(jīng)過 40，50，60，70，80，90 d 發(fā)酵的醬油，對(duì)醬油中的風(fēng)味物質(zhì)種類以及含量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果見圖4～圖7。

圖4 醇類化合物的種類和含量Fig.4 Types and content of alcohols

圖5 酚類化合物的種類和含量Fig.5 Types and content of phenols

圖6 酯類化合物的種類和含量Fig.6 Types and content of esters

由以上4圖可知，在化合物種類和含量上基本上都是Ⅰ組<Ⅱ組<Ⅲ組<Ⅳ組。各化合物除了雜環(huán)類化合物以外，都呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)。但是雜環(huán)類化合物在發(fā)酵90 d時(shí)，仍呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。并且各化合物含量的峰值都出現(xiàn)在80 d附近。并且在發(fā)酵的前70 d，各類化合物的含量差距不大，70 d后差距開始明顯。這說(shuō)明部分微生物在發(fā)酵后期產(chǎn)生香味物質(zhì)。

試驗(yàn)組的醇類物質(zhì)比對(duì)照組豐富。這是由于魯氏酵母是醇香型酵母，可以通過生物合成途徑、Enrlish途徑分別將直鏈氨基酸、支鏈氨基酸轉(zhuǎn)換成相應(yīng)的高級(jí)醇及芳香雜醇，其中Enrlish途徑是生產(chǎn)3-甲基-1-丁醇的唯一途徑[20]。

圖7 雜環(huán)類化合物的種類和含量Fig.7 Types and content of heterocyclic compounds

由圖5可以看出，Ⅲ、Ⅳ兩組中的2-甲氧基-4-乙基苯酚（4-EG）、2-甲氧基-4-乙烯基苯酚（4-VG）要高于Ⅰ、Ⅱ兩組，這是由于Ⅲ、Ⅳ兩組添加了球擬酵母，而4-EG與4-VG使醬油具有特殊香味，并且這兩種化合物具有煙熏及溫和的烤肉味，略帶甜味，微帶酚的氣息，是決定醬油食品品味及質(zhì)量的一個(gè)主要香氣[21-22]。因此，添加球擬酵母發(fā)酵可以明顯改善醬油的風(fēng)味。

由圖6可以看出，添加了球擬酵母的醬油中，酯類物質(zhì)比對(duì)照組豐富。而酯類物質(zhì)可以緩沖醬油中鹽的咸味賦予醬油良好的香味，是醬油中非常重要的風(fēng)味物質(zhì)。酯類可使醬油中苯乙醇等風(fēng)味物質(zhì)香氣更為醇厚，抑制胺類和部分脂肪酸類化合物的刺激感和苦味。從而賦予了醬油良好的口感。

由表2可知，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組測(cè)出了4-羥基-2（或 5）-乙基-5（或 2）-甲基-3（2H）-呋喃酮（HEMF），該物質(zhì)是最近在醬油中分離出的一種重要香氣成分。具有改善香氣、緩和鹽味、增強(qiáng)甜味的作用，具有一種類似西方甜點(diǎn)的強(qiáng)烈香氣。從圖7可以看出，試驗(yàn)組的雜環(huán)類物質(zhì)含量和種類要明顯高于對(duì)照組。說(shuō)明多菌混合發(fā)酵改善了醬油風(fēng)味。

2.3 多菌種發(fā)酵最佳周期探索

將發(fā)酵30～90 d的醬油中的特征性風(fēng)味物質(zhì)總含量利用以下公式進(jìn)行計(jì)算：

式中：y——特征性風(fēng)味物質(zhì)總含量；x——各個(gè)特征性風(fēng)味物質(zhì)的含量。

將計(jì)算所得的特征性風(fēng)味物質(zhì)的含量總和與醬油的發(fā)酵時(shí)間用適當(dāng)?shù)暮瘮?shù)進(jìn)行擬合，得到圖8。

圖8 多菌種發(fā)酵過程中特征性風(fēng)味物質(zhì)含量的變化Fig.8 Fitting curves of characteristic flavor substance content in the process of multi-strain fermentation

由圖顯示，特征風(fēng)味物質(zhì)Ⅳ組＞Ⅲ組＞Ⅱ組＞Ⅰ組。特征性風(fēng)味物質(zhì)的含量呈現(xiàn)先較快上升，后呈現(xiàn)平緩的趨勢(shì)。Ⅳ組的特征性風(fēng)味物質(zhì)的含量最高。酵母菌與乳酸菌對(duì)醬油中的特征性風(fēng)味物質(zhì)形成起著很大的作用。用origin 8對(duì)醬油中的特征性風(fēng)味物質(zhì)與發(fā)酵時(shí)間進(jìn)行曲線擬合，擬合結(jié)果見下表。

根據(jù)以上擬合曲線，可以求出特征性風(fēng)味物質(zhì)可以達(dá)到的最高值，以及特征性風(fēng)味物質(zhì)達(dá)到最高值時(shí)的理論發(fā)酵周期。以Ⅰ組為例，其特征性風(fēng)味物質(zhì)含量與發(fā)酵時(shí)間之間的關(guān)系為：

表3 多菌發(fā)酵過程中特征性風(fēng)味物質(zhì)含量的擬合曲線Table 3 Fitting curves of the characteristic flavor levels of multi-strain fermentation soy sauce

y=-230.83+21.7 t-0.136 t2+1.27×10-4t3

對(duì)函數(shù)求導(dǎo)數(shù)得：y’=21.7-0.272 t+3.81×10-4t2，令y’=0，求得特征性風(fēng)味物質(zhì)y的極值（最大值）為 648.96 μg/L，此時(shí)理論發(fā)酵周期 t=92 d。

同理，Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組的特征性風(fēng)味物質(zhì)含量最高可達(dá) 852.90，982.51，1 897.55 μg/L。其理論發(fā)酵周期分別為：98，99，102 d。不同微生物組合模型下發(fā)酵醬油，理論的最佳發(fā)酵周期是有區(qū)別的。

2.4 醬油的感官鑒定結(jié)果分析

根據(jù)醬油感官評(píng)定規(guī)則，對(duì)4組成品醬油指標(biāo)進(jìn)行定量描述分析，評(píng)價(jià)員為10人（3人來(lái)自醬油企業(yè)，7人來(lái)自實(shí)驗(yàn)室，都經(jīng)過相關(guān)的感官鑒定培訓(xùn)），每次將10名評(píng)價(jià)員的結(jié)果進(jìn)行平均。

表4 4組成品醬油各感官指標(biāo)的定量描述分析統(tǒng)計(jì)結(jié)果Table 4 The result of the sensory evaluation of the soy sauce

為了更清晰地表達(dá)醬油的感官結(jié)果，根據(jù)4組成品醬油的感官定量分析結(jié)果做出雷達(dá)圖[23]，見圖9。

表4顯示了添加不同菌種制曲所得到的醬油的感官評(píng)定結(jié)果。從圖9可以明顯看出，Ⅳ組添加了魯氏酵母、球擬酵母和乳酸菌制曲的醬油其醬香、酯香、鮮味要好于其它組的醬油。Ⅰ組只以米曲霉制曲，所得的醬油的風(fēng)味，香味都要差于多菌制曲所得的醬油。這說(shuō)明了添加了魯氏酵母、球擬酵母和乳酸菌可以促進(jìn)醬油中的風(fēng)味物質(zhì)形成，其口感、口味都要好于只以米曲霉發(fā)酵的醬油。

圖9 醬油各感官指標(biāo)的定量描述分析統(tǒng)計(jì)結(jié)果Fig.9 The result of the sensory evaluation of the soy sauce

由于在感官評(píng)定時(shí)的規(guī)則是當(dāng)某項(xiàng)指標(biāo)狀態(tài)最佳時(shí)為滿分，因此各組在圖9中所圍成的面積越大，其感官越好。各組在圖9中所圍成的圖形面積，可以定量描述醬油綜合感官評(píng)定的結(jié)果。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四組面積分別為：267.03，276.67，302.76，318.93，此即為風(fēng)味所得評(píng)分。可以明顯看出Ⅳ組＞Ⅲ組＞Ⅱ組＞Ⅰ組，這也明顯反映出了添加了魯氏酵母、球擬酵母和乳酸菌制曲的醬油風(fēng)味最好，更受人們的喜愛。

3 結(jié)論

通過對(duì)添加不同菌種組合發(fā)酵所得醬油的理化指標(biāo)以及風(fēng)味物質(zhì)的測(cè)定，發(fā)現(xiàn)多菌種制曲高鹽稀態(tài)發(fā)酵的醬油特征風(fēng)味物質(zhì)含量更高，品質(zhì)更好。發(fā)酵過程中：（1）4組的氨基酸態(tài)氮、還原糖、pH等理化指標(biāo)基本相似，第Ⅳ組的氨基酸態(tài)氮的值（1.378 g/100 mL）略高于其他 3 組；（2）魯氏酵母促進(jìn)了醬油中高級(jí)醇及芳香雜醇的生成，球擬酵母促進(jìn)了醬油中4-EG、4-VG的生成，使醬油具有特殊的香氣，乳酸菌發(fā)酵賦予了醬油爽適的口感，各組風(fēng)味物質(zhì)含量和種類差異非常顯著；（3）對(duì)特征性風(fēng)味物質(zhì)含量與發(fā)酵時(shí)間進(jìn)行曲線擬合，可得到數(shù)學(xué)關(guān)系式（如y=-230.83+21.7 t-0.136 t2+1.27×10-4t3，第Ⅰ組），從關(guān)系式算出Ⅰ組特征性風(fēng)味物質(zhì)最大值分別為：648.96 μg/L（Ⅰ組，發(fā)酵周期 92 d）、852.90 μg/L（Ⅱ組，發(fā)酵周期98 d）、982.51 μg/L（Ⅲ組，發(fā)酵周期 99 d）、1 897.55 μg/L（Ⅳ組，發(fā)酵周期102 d）。多菌種發(fā)酵的醬油獲得了較高的特征性風(fēng)味物質(zhì)含量。以上結(jié)果，對(duì)醬油的多菌混合制曲發(fā)酵實(shí)踐生產(chǎn)中有一定指導(dǎo)意義。