冬凌草乙素通過(guò)Wnt/β-catenin信號(hào)通路對(duì)裸鼠K562細(xì)胞移植瘤的抑制作用

史曉賢 李高文

冬凌草為唇形科香茶菜屬植物碎米椏[Rabdosiarubescens(Hemsl.)Hara]的干燥地上部分，主要產(chǎn)于河南濟(jì)源太行山一帶，具有抗氧化、抗炎及抗腫瘤等作用[1]。由于其優(yōu)秀的抗癌功能，冬凌草被譽(yù)為“紫杉醇第二”[2]。其中，從冬凌草提取的以冬凌草甲素和冬凌草乙素為代表的貝殼杉烷類二萜化合物已被廣泛應(yīng)用于腫瘤的治療研究，它們不僅對(duì)多種腫瘤有效，與其他化學(xué)治療藥物聯(lián)合使用時(shí)可提高療效，還能起降低毒副作用的功效。新近的研究資料表明，冬凌草乙素不僅能通過(guò)誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞的G1期和凋亡來(lái)發(fā)揮其抗腫瘤作用，它還能夠誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞以及白血病細(xì)胞的凋亡[3-6]。同時(shí)，冬凌草乙素可通過(guò)誘導(dǎo)線粒體損傷和調(diào)節(jié)某些凋亡相關(guān)基因的變化來(lái)誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞發(fā)生凋亡[7]。目前，關(guān)于冬凌草乙素對(duì)各種腫瘤細(xì)胞的抑制作用雖有報(bào)道，但其抗腫瘤的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)報(bào)道極少。本研究旨在進(jìn)一步有效開(kāi)發(fā)冬凌草素抗腫瘤作用，以皮下接種K562細(xì)胞建立裸鼠白血病皮下細(xì)胞移植瘤模型，觀察不同劑量的冬凌草乙素對(duì)裸鼠K562皮下細(xì)胞移植瘤生長(zhǎng)的抑制效果并探討其作用機(jī)制，為冬凌草乙素的臨床開(kāi)發(fā)和應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)理論基礎(chǔ)。

材料與方法

一、材 料

BALB/c系裸鼠20只(雌性，4～6周，18～20 g)購(gòu)自常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。人慢性髓原白血病細(xì)胞K562細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所細(xì)胞庫(kù)，冬凌草乙素(>98%)購(gòu)自上海純優(yōu)生物科技有限公司，羥基脲購(gòu)自阿拉丁(H106352，CAS號(hào)127-07-1)，兔單克隆抗體β-鏈蛋白(β-caterin) (ab32572)，兔單克隆抗體細(xì)胞周期蛋白D1(cyclin D1)(ab134175)，兔單克隆抗體c-myc癌基因(c-myc)(ab32072)購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，小鼠單克隆抗體β-actin(AF0003)購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。

二、荷瘤小鼠模型的建立及分組給藥

生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的K562細(xì)胞(2.5×107/ml)接種于裸鼠前肢腋下，每只接種 0.2 ml。當(dāng)腫瘤平均體積達(dá)到80～100 mm3時(shí)，將20只荷瘤裸鼠隨機(jī)分為4組：冬凌草乙素低劑量組(40 mg/kg)；冬凌草乙素高劑量組(80 mg/kg)；陽(yáng)性對(duì)照組：羥基脲(120 mg/kg)；模型對(duì)照組給予等體積生理鹽水。各組動(dòng)物連續(xù)18 d腹腔給藥，每日1次。腫瘤體積每3日測(cè)量1次，測(cè)定腫瘤最長(zhǎng)徑(a)和最短徑(b)并計(jì)算各裸鼠腫瘤體積(腫瘤體積=a×b2/2)[8]。繪制各組腫瘤生長(zhǎng)曲線并作比較。給藥結(jié)束后脫臼處死全部動(dòng)物并迅速剝離出完整的皮下瘤塊，稱其質(zhì)量，并計(jì)算分析比較各組動(dòng)物抑瘤率[抑瘤率= (模型對(duì)照組平均瘤質(zhì)量-給藥組平均瘤質(zhì)量)/模型對(duì)照組平均瘤質(zhì)量×100 %][9]。然后將部分瘤組織放入液氮中保存用做分子檢測(cè)，部分用4%多聚甲醛固定后制備成石蠟切片進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色。

三、逆轉(zhuǎn)錄-PCR(RT-PCR)檢測(cè)各組腫瘤組織β-caterin、cyclin D1、c-myc的信使RNA

稱取約30 mg腫瘤組織塊，用Trizol裂解法提取腫瘤組織總 RNA后逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，并分別對(duì)其進(jìn)行PCR目的擴(kuò)增。引物序列及主要反應(yīng)參數(shù)如下：β-caterin: F-AAA GCG GCT GTT AGT CAC TGG；R-CGA GTC ATT GCA TAC TGT CCA T; c-myc: F-GGC TCC TGG CAA AAG GTC A; R-CTG CGT AGT TGT GCT GAT GT; cyclin D1: F-GCT GCG AAG TGG AAA CCA TC; R-CCT CCT TCT GCA CAC ATT TGA A; β-actin: F-CAT GTA CGT TGC TAT CCA GGC; R-CTC CTT AAT GTC ACG CAC GAT。熒光定量PCR結(jié)果判定: △Ct= Ct目的基因-Ct內(nèi)參，△△Ct=△Ct處理組-△Ct對(duì)照組， RQ(Relative Quantitation)處理組=2-△△Ct，其中模型對(duì)照組RQ值設(shè)為1。以GAPDH為內(nèi)參，依據(jù)2-△△Ct法計(jì)算各信使RNA的相對(duì)表達(dá)量[10]。

四、蛋白免疫印跡法檢測(cè)各組腫瘤組織β-caterin、cyclin D1、c-myc蛋白表達(dá)

稱取50 mg新鮮腫瘤組織提取其總蛋白質(zhì)，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，電泳條件為：60 V、30 min，120 V、90 min。待電泳結(jié)束后采用濕轉(zhuǎn)法將其轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)，用5%牛血清白蛋白(BSA)室溫下脫色搖床上搖動(dòng)封閉1 h后，加入合適濃度的一抗(β-caterin、cyclin D1、c-myc、內(nèi)參抗體β-actin工作濃度均為1∶1 000)，4 °C孵育過(guò)夜。之后用TBST在室溫下脫色搖床上洗3次，每次5 min后加入辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗稀釋液于37°C孵育1 h；TBST洗膜結(jié)束后采用辣根過(guò)氧化物酶增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(HRP-ECL)進(jìn)行顯色、曝光，最后使用圖像分析軟件定量分析陽(yáng)性蛋白的表達(dá)。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、冬凌草乙素對(duì)裸鼠白血病K562皮下細(xì)胞移植瘤生長(zhǎng)情況的影響

如表1所示，4組荷瘤裸鼠治療前和治療后的體質(zhì)量均差異不大，比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0. 05)，見(jiàn)表1。如圖1和表2所示，進(jìn)一步分析腫瘤生長(zhǎng)曲線發(fā)現(xiàn)，冬凌草乙素給藥后腫瘤體積增長(zhǎng)速度降低，用藥結(jié)束后腫瘤體積顯著小于模型對(duì)照組，尤其是冬凌草乙素高劑量組。同時(shí)對(duì)比冬凌草乙素高劑量組與陽(yáng)性對(duì)照組發(fā)現(xiàn)，2組動(dòng)物抑瘤率效果相當(dāng)，比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。綜合分析瘤質(zhì)量及抑瘤率數(shù)據(jù)，表明冬凌草乙素能有效抑制K562細(xì)胞移植瘤的生長(zhǎng)。

表1 冬凌草乙素對(duì)接種K562細(xì)胞裸鼠體質(zhì)量的影響

組 別劑量(mg/kg)體質(zhì)量(g)用藥前用藥后模型對(duì)照組?1933±0452456±072冬凌草乙素低劑量組402041±0562271±056冬凌草乙素高劑量組801993±0622315±045陽(yáng)性對(duì)照組1202072±0492324±059F值20771827P值01800220

圖1 冬凌草乙素對(duì)裸鼠K562細(xì)胞皮下移植瘤體積的影響

A：腫瘤大體圖； B：各組的腫瘤體積隨時(shí)間的變化趨勢(shì)

表2 冬凌草乙素對(duì)裸鼠K562細(xì)胞皮下移植瘤的生長(zhǎng)抑制作用

注：a為與模型對(duì)照組比較的P值

二、冬凌草乙素對(duì)裸鼠白血病K562皮下細(xì)胞移植瘤組織病理情況的影響

光鏡下所見(jiàn)凋亡一般累及單個(gè)或少數(shù)幾個(gè)細(xì)胞，凋亡細(xì)胞呈圓形，胞漿紅染，細(xì)胞核染色質(zhì)聚集成團(tuán)塊狀，由于凋亡細(xì)胞迅速被吞噬，又無(wú)炎癥反應(yīng)，因此在常規(guī)切片檢查時(shí)一般不易發(fā)現(xiàn)。結(jié)果如圖2所示，光鏡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)模型對(duì)照組瘤組織中癌細(xì)胞核大且包膜基本保持完整，胞內(nèi)染色質(zhì)排列整齊、分布均勻，壞死組織部分極少(圖2A)；冬凌草乙素低劑量組能明顯抑制腫瘤細(xì)胞體積，出血壞死較模型對(duì)照組增多且可見(jiàn)核分裂(圖2B)；冬凌草乙素高劑量組腫瘤組織可見(jiàn)大片無(wú)結(jié)構(gòu)的壞死紅染區(qū)域，呈透明樣(圖2C)；陽(yáng)性對(duì)照組少見(jiàn)核分裂，瘤組織出血壞死現(xiàn)象較為廣泛且腫瘤細(xì)胞體積變小明顯(圖2D)，治療效果與冬凌草乙素高劑量組相差不大。

圖2 光鏡觀察K562皮下細(xì)胞移植瘤組織(HE染色,×100)

三、腫瘤組織中 β-caterin、cyclin D1、c-myc 信使RNA 的表達(dá)

與模型對(duì)照組相比，冬凌草乙素各用藥組和羥基脲組腫瘤組織β-caterin、cyclin D1、c-myc 信使RNA表達(dá)水平明顯降低，其中冬凌草乙素高劑量組效果更顯著，與陽(yáng)性對(duì)照組相差不大，見(jiàn)表3。

表3 模型對(duì)照組、冬凌草乙素低及高劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組β-caterin、cyclin D1、c-myc信使RNA水平

注：a為與模型對(duì)照組比較的P值

四、腫瘤組織中β-caterin、cyclin D1、c-myc蛋白的表達(dá)

進(jìn)一步檢測(cè)各組瘤組織中β-caterin、cyclin D1、c-myc的蛋白表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)其蛋白表達(dá)與信使RNA呈相同的趨勢(shì)。與模型對(duì)照組相比，各給藥組腫瘤組織β-caterin、cyclin D1、c-myc表達(dá)均下降，各劑量組間存在明顯的劑量依賴。其中冬凌草乙素高劑量組抑制最強(qiáng)，β-caterin、cyclin D1、c-myc表達(dá)水平分別下降了53%、48%、67%。陽(yáng)性對(duì)照組與冬凌草乙素高劑量組抑制率相差不大，均體現(xiàn)了極強(qiáng)的抑制作用，見(jiàn)表4、圖3。

表4 模型對(duì)照組、冬凌草乙素低及高劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組β-caterin、cyclin D1、c-myc蛋白灰度值

注：a為與模型對(duì)照組比較的P值

圖3 冬凌草乙素對(duì)K562皮下細(xì)胞移植瘤組織β-caterin、cyclin D1和c-myc蛋白表達(dá)的影響

與模型對(duì)照組相比，*為P<0.05，**為P<0.01

討 論

現(xiàn)已證實(shí)冬凌草對(duì)多種腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)較高的抑瘤作用，并且其對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒作用具有選擇性且毒性低。此外，復(fù)方PC-SPES(由冬凌草等七味中草藥組成)在北美地區(qū)已作為治療前列腺癌的替代制劑為廣大患者所接受[8]。作為冬凌草提取物中主要的抗癌活性成分，冬凌草甲素與冬凌草乙素具有相似的藥理活性，不僅能抗突變，抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，還能使腫瘤細(xì)胞的耐藥性逆轉(zhuǎn)，提高抗腫瘤藥的藥效，從而起到抗癌作用。

作為當(dāng)今腫瘤領(lǐng)域國(guó)際研究的一大熱點(diǎn)，Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路分子作為抗腫瘤治療靶點(diǎn)已引起眾多腫瘤和藥物研究者的極大興趣[9]。此信號(hào)通路是一種在多細(xì)胞動(dòng)物體內(nèi)廣泛存在且作用機(jī)制已被研究得相對(duì)清楚的高度保守信號(hào)通路，它與細(xì)胞的多項(xiàng)生理進(jìn)程密切相關(guān)，如細(xì)胞增殖、分化、凋亡以及自我更新。腫瘤疾病的發(fā)生機(jī)制可能與Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路異?；罨嘘P(guān)，這與該通路中某些基因的沉默、缺少或是突變密切相關(guān)[10-12]。作為Wnt/β-catenin信號(hào)通路中的關(guān)鍵調(diào)控因子之一，β-catenin如在細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)增加，其可通過(guò)激活下游途徑引起某些特定靶基因的轉(zhuǎn)錄，從而引發(fā)腫瘤等疾病。Wnt基因家族是小分子量分泌型糖蛋白，具有高度保守性，由19種基因型構(gòu)成，350～400個(gè)氨基酸編碼組成半胱氨酸殘基，不僅能調(diào)節(jié)干細(xì)胞的分化，還能在細(xì)胞增殖和凋亡等生理進(jìn)程中發(fā)揮作用[13-15]。β-catenin 基因是Wnt/β-catenin通路的主要調(diào)控靶點(diǎn)，而cyclin D1、c-myc是Wnt/β-catenin信號(hào)通路的下游靴基因[16]。

本課題組通過(guò)比較陽(yáng)性藥羥基脲和高、低劑量冬凌草乙素對(duì)K562皮下細(xì)胞移植瘤模型的治療作用，發(fā)現(xiàn)高劑量冬凌草乙素的抑瘤效果優(yōu)于低劑量組，且與羥基脲作用相當(dāng)，說(shuō)明冬凌草乙素對(duì)于K562腫瘤的確有明顯的抑制作用，且具有劑量依賴性。不僅如此，通過(guò)分析用藥期間裸鼠體質(zhì)量的變化，我們還發(fā)現(xiàn)即使給予很大濃度的冬凌草乙素，毒性作用依然很低，并沒(méi)有相應(yīng)增加。這些結(jié)果與大量前期對(duì)冬凌草乙素的體外研究不謀而合，劉家軍等[12]發(fā)現(xiàn)冬凌草乙素在體外能使Caspase-3和Caspase-9活化，從而抑制K562腫瘤細(xì)胞。

同時(shí)，本研究的HE染色結(jié)果顯示冬凌草乙素給藥處理組裸鼠腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)明顯的凋亡和壞死現(xiàn)象。實(shí)時(shí)熒光定量PCR和蛋白免疫印跡結(jié)果顯示，與模型對(duì)照組相比，冬凌草乙素組腫瘤組織β-caterin、cyclin D1和c-myc信使RNA的表達(dá)明顯下調(diào)；與模型對(duì)照組相比，冬凌草乙素各劑量處理組均能下調(diào)腫瘤組織中的β-caterin、cyclin D1和c-myc蛋白表達(dá)。由此，我們猜測(cè)冬凌草乙素是通過(guò)影響Wnt/β-catenin信號(hào)通路來(lái)發(fā)揮對(duì)K562細(xì)胞的抑制作用。本研究為冬凌草乙素在慢性髓系白血病治療中的應(yīng)用提供了分子基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

[1] 高世勇，王瓏. 冬凌草的化學(xué)和藥理作用研究. 哈爾濱商業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2014,30(1)：1-6.

[2] 徐錚奎. 冬凌草有望成為“紫杉醇第二”. 中國(guó)現(xiàn)代中藥, 2007, 9(8)：43-45.

[3] Du J, Chen C, Sun Y, Zheng L, Wang W. Ponicidin suppresses HT29 cell growth via the induction of G1 cell cycle arrest and apoptosis. Mol Med Rep, 2015, 12(4):5816-5820.

[4] Liu YF, Lu YM, Qu GQ, Liu Y, Chen WX, Liao XH, Kong WM. Ponicidin induces apoptosis via JAK2 and STAT3 signaling pathways in gastric carcinoma. Int J Mol Sci, 2015, 16(1):1576-1589.

[5] Zhang JF, Liu PQ, Chen GH, Lu MQ, Cai CJ, Yang Y, Li H. Ponicidin inhibits cell growth on hepatocellular carcinoma cells by induction of apoptosis. Dig Liver Dis, 2007, 39(2):160-166.

[6] Liu JJ, Zhang Y, Guang WB, Yang HZ, Lin DJ, Xiao RZ. Ponicidin inhibits monocytic leukemia cell growth by induction of apoptosis. Int J Mol Sci, 2008, 9(11):2265-2277.

[7] Liu JJ, Huang RW, Lin DJ, Peng J, Zhang M, Pan X, Hou M, Wu XY, Lin Q, Chen F. Ponicidin, an ent-kaurane diterpenoid derived from a constituent of the herbal supplement PC-SPES, Rabdosia rubescens, induces apoptosis by activation of caspase-3 and mitochondrial events in lung cancer cells in vitro. Cancer Invest, 2006, 24(2):136-148.

[8] Bi D, Yang M, Zhao X, Huang S. Effect of cnidium lactone on serum mutant P53 and BCL-2/BAX expression in human prostate cancer cells PC-3 tumor-bearing BALB/C nude mouse model. Med Sci Monit, 2015, 21: 2421-2427.

[9] 王云飛， 顧政一， 聶勇戰(zhàn)， 韓亞楠， 魏彥玲， 金治安. 貝母素乙增強(qiáng)阿霉素對(duì)胃癌多藥耐藥裸鼠移植瘤的抑制作用及其機(jī)制研究. 中草藥, 2014, 45(5):686-690.

[10] 黃慶, 鄒旻紅, 鄧偉雄, 羅時(shí)敏, 焦興元, 曹杰. Tgf-p誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞向腫瘤干細(xì)胞分化的研究. 新醫(yī)學(xué), 2017，48(7): 449-454.

[11] Zhong Y, Lin Y, Shen S, Zhou Y, Mao F, Guan J, Sun Q. Expression of ALDH1 in breast invasive ductal carcinoma: an independent predictor of early tumor relapse. Cancer Cell Int, 2013,13(1):60. Meade-Tollin LC, Wijeratne EM, Cooper D, Guild M, Jon E, Fritz A, Zhou GX, Whitesell L, Liang JY, Gunatilaka AA. Ponicidin and oridonin are responsible for the anti-angiogenic activity of Rabdosia rubescens, a constituent of the herbal supplement PC SPES. J Nat Prod, 2004, 67(1):2-4.

[12] 李天曉, 元?jiǎng)? 葉麗君, 孫健, 黎曙霞. 棉酚衍生物apog2誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡及對(duì)wnt6調(diào)控作用的研究.新醫(yī)學(xué)，2014，45(6):359-363.

[13] Van Zuylen WJ, Rawlinson WD, Ford CE. The Wnt pathway: a key network in cell signalling dysregulated by viruses. Rev Med Virol, 2016, 26(5):340-355.

[14] Carotenuto P, Fassan M, Pandolfo R, Lampis A, Vicentini C, Cascione L, Paulus-Hock V, Boulter L, Guest R, Quagliata L, Hahne JC, Ridgway R, Jamieson T, Athineos D, Veronese A, Visone R, Murgia C, Ferrari G, Guzzardo V, Evans TRJ, MacLeod M, Feng GJ, Dale T, Negrini M, Forbes SJ, Terracciano L, Scarpa A, Patel T, Valeri N, Workman P, Sansom O, Braconi C. Wnt signalling modulates transcribed-ultraconserved regions in hepatobiliary cancers. Gut, 2016, doi: 10.1136/gutjnl-2016-312278.

[15] Liu JJ, Huang RW, Lin DJ, Wu XY, Lin Q, Peng J, Pan X, Song YQ, Zhang MH, Hou M, Chen F. Antiproliferation effects of ponicidin on human myeloid leukemia cells in vitro. Oncol Rep, 2005, 13(4):653-657.