豬巴氏桿菌病診斷技術(shù)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)修訂

李偉杰 ， 張 媛 ， 李 建 ， 魏財(cái)文 ， 蔣玉文

(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所 ， 北京 海淀 100081)

1 修訂豬巴氏桿菌病診斷技術(shù)的必要性

豬巴氏桿菌病，又稱豬肺疫，是危害我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的重要疫病之一，我國(guó)將之定為二類動(dòng)物疫病。豬巴氏桿菌病是由多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocida)引起的一種以敗血癥和炎性出血為特征的豬傳染病。病原主要存在于病豬肺臟病灶及豬的上呼吸道與消化道中，隨分泌物及排泄物排出體外，健康豬如接觸病豬的排泄物被污染物時(shí)，經(jīng)消化道和呼吸道傳染，即可感染發(fā)病。當(dāng)帶菌豬由于受冷、感冒、饑餓、飼養(yǎng)管理不善、營(yíng)養(yǎng)不良和寄生蟲感染等，使抵抗力降低時(shí)，可促使豬發(fā)病。大小豬均有易染性，小豬和中豬發(fā)病率較高。一年四季都可發(fā)生，特別是春秋兩季更易發(fā)生，此病多發(fā)生于其他傳染病之后。也可呈地方流行性發(fā)生。每年我國(guó)生產(chǎn)約1.5億頭份各類豬巴氏桿菌病相關(guān)疫苗，盡管如此，各地仍有發(fā)病。

用特異性莢膜抗原吸附于紅細(xì)胞上作被動(dòng)血凝試驗(yàn)，可將多殺性巴氏桿菌分為A、B、D、E和F 5種血清群；利用菌體抗原作凝集試驗(yàn)，將本菌分為16個(gè)血清型。特異性莢膜抗原用大寫英文字母表示，菌體抗原用阿拉伯?dāng)?shù)字表示，將菌體型和莢膜型兩者結(jié)合起來(lái)表示，如5：A，6： B，2：D等。我國(guó)對(duì)本菌血清學(xué)鑒定表明，只有A、B和D 3個(gè)血清群，沒有E和F血清群。豬以A型及B型為最常見。該病的病型、宿主特異性、致病性、免疫性等，都與血清型有關(guān)。

2001年Townsend通過(guò)消減雜交確定了多殺性巴氏桿菌種特異性基因kmtⅠ，針對(duì)該特異性DNA序列設(shè)計(jì)引物，所有的多殺性巴氏桿菌都可以擴(kuò)增出一個(gè)460 bp的片段，由此建立了多殺性巴氏桿菌定種的PCR鑒定方法；另外，他對(duì)不同莢膜型的多殺性巴氏桿菌的莢膜合成相關(guān)基因進(jìn)行了克隆和分析，多殺性巴氏桿菌莢膜型A、B、D、E、F菌株的生物合成位點(diǎn)的基因分別是hyaD-hyaC、bcbD、dcbF、ecJ、fcbD等，針對(duì)這幾種莢膜合成基因位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增出的片段大小分別為1044、760、657、51l bp和851 bp，由此建立了莢膜分型PCR[1]。

行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《豬巴氏桿菌病診斷技術(shù)》(NY/T 564-2002)于2002年予以實(shí)施，其中病原鑒定、血清學(xué)試驗(yàn)等均通過(guò)菌株表型特征予以確定，廣大獸醫(yī)工作者參照此標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行豬巴氏桿菌病的診斷[2-5]。近年來(lái)，分子生物學(xué)技術(shù)已經(jīng)在巴氏桿菌病診斷中得以應(yīng)用，這些新技術(shù)均相比傳統(tǒng)診斷技術(shù)更加快速便捷?！敦i巴氏桿菌病診斷技術(shù)》標(biāo)準(zhǔn)(NY/T564-2002)診斷周期較長(zhǎng)，不適于該病的大規(guī)?？焖僭\斷。因此，有必要對(duì)2002版標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行修訂，增加上述成熟的快速診斷技術(shù)，以便縮短疾病診斷周期，快速作出診斷，對(duì)防制起到積極作用。

2 修訂豬巴氏桿菌病診斷技術(shù)的依據(jù)和基礎(chǔ)

豬巴氏桿菌病診斷技術(shù)經(jīng)過(guò)10余年的發(fā)展，許多新的技術(shù)，特別是分子生物學(xué)技術(shù)，已經(jīng)在多殺性巴氏桿菌病診斷中得以應(yīng)用。PCR方法采用的是設(shè)計(jì)一對(duì)針對(duì)基因組某保守基因的引物，進(jìn)行體外核酸擴(kuò)增，然后用瓊脂糖凝膠電泳的方法來(lái)分離該擴(kuò)增片段，并進(jìn)行大小和序列分析。多殺性巴氏桿菌菌種特異性PCR對(duì)豬巴氏桿菌病的快速診斷意義重大。多殺性巴氏桿菌種特異性基因kmtⅠ是多殺性巴氏桿菌基因組上一個(gè)特有區(qū)域，針對(duì)本菌該特異性DNA序列設(shè)計(jì)引物，所有的多殺性巴氏桿菌都可以擴(kuò)增出一個(gè)460 bp的片段。

傳統(tǒng)的多殺性巴氏桿菌莢膜定型技術(shù)比較繁瑣，個(gè)別菌株由于體外培養(yǎng)莢膜會(huì)消失，所以需要先回歸動(dòng)物，再重新分離細(xì)菌制備莢膜抗原進(jìn)行間接血凝試驗(yàn)[6]。多殺性巴氏桿菌莢膜型A、B、D、E型菌株和F型菌株的生物合成位點(diǎn)的基因分別是hyaD-hyaC、bcbD、dcbF、ecbJ、fcbD等，它們編碼的莢膜多糖成分已經(jīng)通過(guò)核磁共振檢查研究證實(shí)。多殺性巴氏桿菌A型菌株的莢膜多糖成分是透明質(zhì)酸；B型菌株的莢膜多糖是由阿拉伯糖、甘露糖和半乳糖組成；D型菌株的莢膜物質(zhì)是一種類似于肝素的多糖。針對(duì)這幾種莢膜合成基因位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增出的片段大小分別為1 044、760、657、51l bp和851 bp，由此建立了莢膜分型PCR。該方法也得到國(guó)內(nèi)研究者的證實(shí)[7-9]。

Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals 2014已將kmtⅠ作為靶基因建立多殺性巴氏桿菌的PCR診斷技術(shù)，用于出血性敗血癥的病原鑒定，同時(shí)在牛出血性敗血癥和豬萎縮性鼻炎的病原多殺性巴氏桿菌的莢膜定型中應(yīng)用了多重PCR。本課題組運(yùn)用建立的多殺性巴氏桿菌定種PCR和莢膜定型多重PCR對(duì)60株多殺性巴氏桿菌進(jìn)行了鑒定，結(jié)果與16S rDNA PCR和間接血凝試驗(yàn)結(jié)果的符合率均達(dá)100%[10]。以上研究為本標(biāo)準(zhǔn)的修訂提供了理論和技術(shù)支持。

3 修訂豬巴氏桿菌病診斷技術(shù)的主要工作過(guò)程

從中國(guó)獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心領(lǐng)取63株不同型的致病性豬源多殺性巴氏桿菌，獲得純培養(yǎng)物。采用細(xì)菌16S rDNA通用引物對(duì)所領(lǐng)取的63株菌的16S rDNA進(jìn)行擴(kuò)增，經(jīng)核酸序列比對(duì)確定該63株菌中有60株為多殺性巴氏桿菌。合成多殺性巴氏桿菌種特異性引物及對(duì)應(yīng)于莢膜A、B、D血清型基因的特異性引物，用多殺性巴氏桿菌種特異性PCR方法對(duì)已確定為多殺性巴氏桿菌的60株菌進(jìn)行種鑒定，結(jié)果均吻合。制備了多殺性巴氏桿菌莢膜定型血清，用傳統(tǒng)的間接血凝試驗(yàn)及莢膜定型PCR方法對(duì)上述60株豬多殺性巴氏桿菌進(jìn)行莢膜定型，結(jié)果也均一致。結(jié)合研究結(jié)果，將通過(guò)PCR確定多殺性巴氏桿菌種及莢膜血清型的方法優(yōu)化，規(guī)范和制定所有的操作過(guò)程和細(xì)節(jié)，對(duì)《豬巴氏桿菌病診斷技術(shù)》(NY/T 564-2002)進(jìn)行修訂，起草修訂草案。委托與本專業(yè)相關(guān)的11家技術(shù)單位對(duì)本標(biāo)準(zhǔn)修訂草案進(jìn)行技術(shù)復(fù)核并提出修改意見和建議。對(duì)征集到的意見及建議進(jìn)行匯總，根據(jù)技術(shù)復(fù)核單位的復(fù)核結(jié)果及提出的修改意見對(duì)《標(biāo)準(zhǔn)》進(jìn)行修改完善，形成送審稿。參加全國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)組織專家召開的標(biāo)準(zhǔn)審定會(huì)，按照專家意見對(duì)《標(biāo)準(zhǔn)》再次進(jìn)行修改完善，形成報(bào)批稿。2016年10月26日農(nóng)業(yè)部發(fā)布為中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(農(nóng)業(yè)部公告第2461號(hào))，自2017年4月1日起實(shí)施[11]。

4 修訂豬巴氏桿菌病診斷技術(shù)的技術(shù)復(fù)核

將25株莢膜A型多殺性巴氏桿菌、18株B型多殺性巴氏桿菌、10株D型多殺性巴氏桿菌、1株E型多殺性巴氏桿菌、2株F型多殺性巴氏桿菌及大腸埃希菌、沙門菌、胸膜肺炎放線桿菌、支氣管敗血波氏菌各1株委托農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)診斷中心、北京市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心、天津市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心、中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所、廣西獸醫(yī)研究所、北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所、山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所、湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所、青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院、華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院、四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院共11家科研院所采用標(biāo)準(zhǔn)中新增的病原鑒定中的分子生物學(xué)鑒定法—定種PCR鑒定方法和莢膜定型的多重PCR鑒定方法進(jìn)行技術(shù)復(fù)核，各菌株均至少由2家單位對(duì)其進(jìn)行鑒定。11家單位出具的復(fù)核結(jié)果表明，定種PCR鑒定方法和莢膜定型的多重PCR鑒定方法均具備良好的特異性及穩(wěn)定的重復(fù)性，可實(shí)現(xiàn)豬巴氏桿菌病病原的快速鑒定，滿足豬巴氏桿菌病快速診斷的需求。

5 修訂豬巴氏桿菌病診斷技術(shù)的主要內(nèi)容

“范圍”部分增述了多殺性巴氏桿菌定種的PCR鑒定方法和莢膜定型的多重PCR鑒定方法的適用性?！芭R床診斷”及“病理剖檢”部分參照《獸醫(yī)傳染病學(xué)》(陳溥言主編)[12]中相關(guān)描述進(jìn)行了修改。 “病原分離”部分刪除了不適宜多殺性巴氏桿菌生長(zhǎng)的麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，并將改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基和馬丁肉湯培養(yǎng)基改為更適宜多殺性巴氏桿菌生長(zhǎng)的胰蛋白大豆瓊脂培養(yǎng)基和胰蛋白大豆肉湯培養(yǎng)基。新增了定種PCR鑒定方法。“莢膜血清型鑒定”部分在原有的間接血凝試驗(yàn)( Carter氏莢膜定型法)的基礎(chǔ)上又新增了另一種選擇—多重PCR莢膜定型法，并對(duì)多殺性巴氏桿菌間接血凝試驗(yàn)程序表也進(jìn)行了完善?！案戒汚”部分增添了胰蛋白大豆瓊脂培養(yǎng)基(TSA)和胰蛋白大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB)的制備方法。

6 展望

豬巴氏桿菌病又稱豬肺疫，是由多殺性巴氏桿菌引起的一種以敗血癥和炎性出血為特征的豬傳染病。大小豬均有易染性，小豬和中豬發(fā)病率較高。一年四季都可發(fā)生，特別是春秋兩季更易發(fā)生，此病多發(fā)生于其他傳染病之后，也可呈地方流行性發(fā)生。最急性型死亡率可達(dá)100%，急性型和慢性型死亡率可達(dá)60%，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重危害我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。

運(yùn)用新增的多殺性巴氏桿菌定種PCR方法對(duì)臨床病例診斷時(shí)，與傳統(tǒng)診斷方法相比，可提前7～10天確診，有利于及早對(duì)患病豬進(jìn)行隔離治療，對(duì)健康豬群采取預(yù)防措施，有效降低患病豬的死亡率和發(fā)病率，縮短患病豬的病程和提高治愈率及飼料報(bào)酬，從而降低由多殺性巴氏桿菌病造成的經(jīng)濟(jì)損失。 本標(biāo)準(zhǔn)的修訂可實(shí)現(xiàn)豬巴氏桿菌病病原的快速鑒定，滿足豬巴氏桿菌病快速診斷的需求，對(duì)提高豬群的生產(chǎn)性能有積極作用。

在多殺性巴氏桿菌種的鑒定時(shí)，新增的定種PCR方法比傳統(tǒng)的定種方法(如生理生化)更加準(zhǔn)確快捷，僅依靠定種PCR結(jié)果就可以確診病原，另外該方法較為方便開展該病的大規(guī)模流行病學(xué)調(diào)查。在多殺性巴氏桿菌莢膜定型時(shí)，新增的莢膜定型多重PCR方法試驗(yàn)時(shí)間短、操作簡(jiǎn)便，不用制備莢膜A型、B型、D型定型血清和被檢多殺性巴氏桿菌莢膜抗原致敏紅細(xì)胞，莢膜定型多重PCR試驗(yàn)所用的試劑均已商品化，易于獲取，減少了檢驗(yàn)者的人員誤差。從提升診斷技術(shù)水平上講，該標(biāo)準(zhǔn)也將發(fā)揮積極的促進(jìn)作用，將分子生物學(xué)技術(shù)添加進(jìn)原有標(biāo)準(zhǔn)中，縮短診斷周期，使診斷結(jié)果更加準(zhǔn)確，有利于臨床獸醫(yī)工作者更早做出正確診斷，降低疾病損失。

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