腎纖維化動物模型特點與研究進展

馬園園，劉成海,2，陶艷艷*

(1. 上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院 肝病研究所，上?！?01203； 2. 上海市中醫(yī)臨床重點實驗室，上海　201203)

腎纖維化是腎單位損壞，間質(zhì)中成纖維細胞的大量增生及肌成纖維細胞的形成、細胞外基質(zhì)生成過度并沉積發(fā)生的腎小球硬化(glomerulosclerosis，GS)、腎間質(zhì)纖維化(renal interstitial fibrosis，RIF)，并最終喪失腎功能。確診腎纖維化的金指標為腎組織的病理學檢查，包括觀察腎小管、間質(zhì)和腎小球基底膜的病理形態(tài)。腎纖維化的大體病理觀察主要是：腎臟明顯硬化、減小，表面不平整、顆粒樣變；鏡下觀：腎間質(zhì)炎性細胞彌漫性浸潤、間質(zhì)纖維組織增殖、纖維化形成；腎小球大部分發(fā)生硬化、透明樣改變，毛細血管破壞，系膜基質(zhì)增生；由于腎小球血流受阻，而造成腎小管發(fā)生萎縮，病變輕處，殘余腎代償性增大；生化檢測主要表現(xiàn)在血清尿素氮 (blood urea nitrogen，BUN)、血清肌酐 (serum creatinine，SCr)、24 h尿蛋白定量異常[1]。

誘導腎纖維化的方法主要有藥物或毒物 (氯化汞、環(huán)孢素 A、腎毒性藥物、氨基糖苷類藥物等)、手術(shù)(輸尿管單側(cè)結(jié)扎、5/6腎切除模型、腎缺血-再灌注等)、單側(cè)腎切除復合 Ang Ⅱ 等復合因素以及轉(zhuǎn)基因模型等等，本文對常見模型綜述如下。

1　藥物或毒物誘導模型

重金屬如汞；抗腫瘤藥物如阿霉素；氨基糖苷類抗生素如鏈脲霉素；含有馬兜鈴酸的中草藥；血管緊張素Ⅱ；器官移植術(shù)后的免疫抑制劑類藥物如環(huán)孢素 A 等，均可損傷腎造成纖維化。

1.1　氯化汞模型

汞化合物是公害嚴重的環(huán)境污染物，腎為汞毒性的最主要靶器官之一，損傷以近曲小管為主。主要機理：HgCl2中毒后，主要與體內(nèi)抗氧化物質(zhì)-還原型谷胱甘肽 (GSH) 結(jié)合，形成復合物-“GSH- HG- GSH”，損耗抗氧化物GSH等，并產(chǎn)生活性氧自由基 ROS，屬于氧化應(yīng)激損傷類型[2]。ROS能使腎小管上皮細胞形成空泡、變性與壞死等改變；另一方面，過氧化產(chǎn)物如丙二醛(MDA)等可直接促使腎ECM生成細胞活化，使ECM生成增加，降解減少，造成腎小管間質(zhì)纖維化。

造模方法：大鼠8 mg/(kg·d) HgCl2灌胃，共9周。腎組織病理可見：腎小管間質(zhì)水腫，炎性細胞廣泛浸潤，細胞外基質(zhì)增加，間質(zhì)發(fā)生纖維化；腎小管擴張或萎縮；腎小球萎縮、硬化，小球的基底膜變厚等病理改變；腎功能：BUN、SCr均升高約1.2倍[3-4]。袁繼麗等[5]也報道，大鼠20 mg/(kg·d) HgCl2灌胃，1周即可造成明顯腎功能損壞，腎間質(zhì)大量炎性細胞浸潤、腎小管膨脹變性，免疫組化顯示腎小管的上皮細胞及腎間質(zhì)大量表達α- SMA。HgCl2短時間染毒盡管顯示有腎間質(zhì)纖維化，但所用HgCl2劑量比較多，模型以急性腎損傷為主。

1.2　阿霉素(多柔比星)模型

阿霉素(adriamycin，ADM) 為臨床上用于化療的含醌的蒽環(huán)類藥物。經(jīng)腎代謝后，阿霉素被還原成半醌型自由基，氧化后有活性氧生成，在多種脂質(zhì)介質(zhì)如血小板活化因子等的作用下，誘導腎小球上皮細胞 (又稱足細胞) 發(fā)生脂質(zhì)過氧化，腎小球濾過模受損，通透性增加，進而影響糖蛋白的代謝；腎小球的濾過屏障由于濾過膜被破壞而受影響，造成腎損傷。病變前期以微小病變性腎病綜合征為主，后期可進展至局灶節(jié)段性腎小球硬化[6]。阿霉素腎病模型為國內(nèi)國外目前一致認同的模擬人類微小病變性和局灶節(jié)段性腎小球硬化腎病綜合征較好的動物模型[7]。該模型有低蛋白血癥、高脂血癥、大量蛋白尿等表現(xiàn)。

造模方法：藺建軍[8]以4 mg/kg ADR尾靜脈注射，1 周后以2 mg /kg再注射，3周時間能成功造成阿霉素大鼠的腎病綜合征模型。病理改變，肉眼可見腎皮質(zhì)為蒼白色，髓質(zhì)與皮質(zhì)部分分界不明顯。腎組織鏡下可見：腎小球體積變大，腎小囊囊壁變厚、囊腔擴張，球囊發(fā)生黏連，毛細血管管腔縮小，腎小球表現(xiàn)為局灶節(jié)段性硬化改變。腎小管擴大，上皮細胞顆粒變性，蛋白管型多見，間質(zhì)廣泛炎性細胞浸潤；模型組24 h尿蛋白增加約45倍。

亦有報道小鼠尾靜脈以單次注射 ADR 10 mg/kg[9-10]，6周后病理可見：大部分腎小球呈局灶節(jié)段性硬化，足突細胞融合變形，毛細血管袢堵塞、充血。蛋白管型形成，腎小管顯著擴大，發(fā)生間質(zhì)纖維化。腎功能：BUN升高1.4倍左右。阿霉素的組織毒性很強，注射時如果有溢出，大鼠的尾部則易發(fā)生缺血壞死、潰爛等，引起感染甚至導致尾部脫落，造成模型大鼠死亡。

1.3　馬兜鈴酸模型

馬兜鈴酸 (aristolochic acid，AA)屬于硝基菲類有機酸化合物，為細辛、馬兜鈴、廣防己、關(guān)木通等中草藥的主要成分。AA誘發(fā)腎小管上皮細胞及間質(zhì)成纖維細胞損傷，導致腎小管萎縮、間質(zhì)纖維化，但作用機制尚未完全明確[11]，其腎損傷的主要特點表現(xiàn)為腎小管變性、壞死、腎小管周圍毛細血管丟失、間質(zhì)纖維化，對腎小球影響的報到較少見。

造模方法：大鼠5 mg/(kg·d) AA灌胃，連續(xù)8周。腎組織病理：腎小球的體積變大，基底膜呈重度膨大；腎小管上皮細胞明顯腫大；腎間質(zhì)有增生的成纖維細胞和炎性細胞廣泛浸潤。腎功能：Scr升高1.2倍左右，BUN升高1.1倍左右。尿β2-MG升高約1.7倍[12]。另有報道，大鼠10 mg/(kg·d) AA灌胃，共4周。腎小管上皮細胞發(fā)生凋亡，腎小球基底膜變厚。腎間質(zhì)出現(xiàn)炎性細胞輕微浸潤，膠原纖維增生明顯。腎功能：BUN升高1.5倍左右，Scr升高約1.3倍[13]。

1.4　環(huán)孢素A模型

鈣調(diào)素抑制劑環(huán)孢素A (cyclosporine A，CsA) 為強效免疫抑制劑，臨床上肝、心臟、肺、腎等器官移植術(shù)后應(yīng)用較多。腎毒性是 CsA最突出的副反應(yīng)，主要表現(xiàn)為進行性的腎功能降低以及不可逆性腎小管及血管等組織結(jié)構(gòu)損傷，包括腎小管基底膜萎縮，上皮細胞腫脹、變性甚至壞死或脫落等，腎間質(zhì)炎性細胞廣泛浸潤，腎慢性缺血，間質(zhì)纖維化呈條帶狀或灶狀，腎小球硬化等[14]。

造模方法：大鼠15 mg/ (kg·d) CsA皮下注射，共4周；或30 mg/(kg·d)灌胃，4周。腎組織病理：腎小管萎縮和間質(zhì)炎性細胞彌漫性浸潤并發(fā)生纖維化；腎小球硬化，小球動脈內(nèi)膜顯著增生，管腔接近閉塞。腎功能：BUN升高約1.9倍，SCr升高約1.4倍[15-16]。

造模費用昂貴，且CsA具有肝毒性，另外因服用CsA所致的RIF在臨床上所占比例有限等，限制了該模型的應(yīng)用。

1.5　腺嘌呤模型

腺嘌呤屬于嘌呤類含氮雜環(huán)化合物，主要用在化療藥物造成的白細胞減少癥。有研究顯示[17]，腺嘌呤于黃嘌呤氧化酶的催化下生成2，8-二羥基腺嘌呤，后者使腎小管發(fā)生堵塞，氮質(zhì)化合物的排出受影響，造成血清尿素氮、肌酐、尿酸顯著升高；過飽和的尿酸在血中生成結(jié)晶，在腎小管、間質(zhì)及腎小球部位沉積，形成異物使局部發(fā)生肉芽腫性炎癥，大量腎單位損傷，最終發(fā)生腎間質(zhì)纖維化。

造模方法：大鼠以0.75%腺嘌呤飼料喂養(yǎng)4～6周。結(jié)果：腎小管腫大或萎縮甚至有壞死，腎間質(zhì)炎性細胞彌漫性浸潤并出現(xiàn)廣泛纖維化。BUN、SCr均升高超過10倍[18-19]。連琦等[20]報道：250 mg/kg腺嘌呤灌胃，前2周每天1次，后2周以相同濃度采取2 d 1次灌胃。4周可復制出腎損傷較重，腎間質(zhì)纖維化的大鼠模型。

該模型造模時間如果小于4周，容易發(fā)生腎功能復常。該模型為腺嘌呤復合物沉積于腎小管及間質(zhì)引起堵塞，類似于臨床上腎后性梗阻形成的慢性腎衰。主要用于腎間質(zhì)纖維化、慢性間質(zhì)性腎炎及局灶節(jié)段性腎小球硬化的研究。

1.6　血管緊張素Ⅱ模型

腎是高血壓損傷的重要靶器官之一，高血壓引起腎損傷進一步發(fā)展為腎功能衰竭。腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(renin-angiotensin-aldosterone system， RAAS)激活及腎局部血管緊張素Ⅱ (Ang Ⅱ)產(chǎn)生增多為腎纖維化的形成與發(fā)展的始因。Ang Ⅱ作為RAAS激活的產(chǎn)物，升高全身血壓及腎小球毛細血管內(nèi)壓，作用于腎的AT1、AT2受體，可調(diào)節(jié)細胞增殖，肥大，炎性細胞活化以及纖維化，形成腎小動脈硬化或腎實質(zhì)損害。

造模方法：15 mg/mL血管緊張素Ⅱ溶液灌進膠囊滲透壓泵，手術(shù)將泵塞入小鼠背部皮下，2000 ng/(kg·min)泵出，共6周。腎組織病理：腎小球硬化，伴腎小管擴大，刷狀緣脫落，蛋白管型形成，腎間質(zhì)增多，小動脈增粗硬化[21-23]。

1.7　鏈脲霉素模型

鏈脲霉素是一種從鏈霉菌中提取的抗生素，能特異性破壞胰島β細胞，誘發(fā)糖尿病，高血糖介導代謝失常及血流動力學改變，造成糖尿病性腎病。

造模方法：鏈脲霉素200 mg/ (kg·d)小鼠腹腔注射，連續(xù)8周。病理結(jié)果：腎小球體積增大，系膜基質(zhì)明顯增生，腎小囊與腎小球上皮細胞發(fā)生粘連，出現(xiàn)腎小球硬化。生化結(jié)果：血糖、BUN、SCr、24 h尿白蛋白/尿肌酐比值明顯升高[24-25]。

2　手術(shù)模型

手術(shù)模型通過減少腎單位，造成殘余腎的血流量和 GRF增加，從而導致腎的壓力增大，腎實質(zhì)內(nèi)炎性細胞浸潤，并引起高血壓、蛋白尿，最終形成腎纖維化。目前應(yīng)用較多的有單側(cè)輸尿管梗阻模型、5/6腎切除模型、缺血再灌注模型等，分述如下：

2.1　單側(cè)輸尿管梗阻 (unilateral ureteral obstruction，UUO) 模型

造模方法：大鼠左側(cè)輸尿管中上1/3處離斷，兩端結(jié)扎，2～4周。病理結(jié)果：腎間質(zhì)膠原纖維增生、炎性細胞彌漫性浸潤，腎小管萎縮或擴張；腎小球基底膜變厚、小球玻璃樣改變。血生化：BUN升高1～1.5倍，SCr升高2倍左右。該模型腎纖維化特征明顯，死亡率低，較適用于對腎間質(zhì)纖維化的研究[26-28]。該模型模擬臨床輸尿管梗阻導致腎間質(zhì)損傷，是研究較成熟的理想腎間質(zhì)纖維化模型。

2.2　5/6腎切除模型

切除大鼠左側(cè)腎外緣及上、下極共約2/3左腎； 1周后再切除整個右側(cè)腎，2次一共切約5/6腎。動態(tài)觀察5～12周。病理結(jié)果：腎小球系膜外基質(zhì)增加，系膜細胞增生，毛細血管擴張或閉塞，腎小球局灶性或全部硬化，腎小管萎縮或擴張，大量蛋白管型，腎間質(zhì)增多，炎性細胞彌漫性浸潤[29-31]。殘存腎單位高灌注、高壓力、高濾過引起蛋白尿，加速腎功能缺失；殘腎代償，纖維化形成。該模型因造模技術(shù)較簡單，手術(shù)操作時間短，操作器械易獲取，模型成功率高等而被廣泛采用。

2.3　缺血再灌注模型

缺血再灌注損傷為臨床上腎移植發(fā)病的主要病因。短時間缺血引起的損傷可逆，但長時間缺血再灌注后會造成腎組織、細胞結(jié)構(gòu)的不可逆性損傷，導致腎組織纖維化的發(fā)生[32]。該模型與臨床腎移植、腎部分切除術(shù)、休克、血管阻塞后再通等缺血再灌注損傷相似。

造模方法：動脈夾夾閉大鼠左腎動脈30～45 min，切除右腎，再去掉動脈夾，使血流灌注恢復，共4周。病理結(jié)果：腎小管萎縮或消失，并伴有間質(zhì)纖維化，小球硬化表現(xiàn)。腎功能：SCr升高2倍左右，BUN升高約1.5倍[33-34]。

3　復合模型

3.1　葉酸合Phd14基因敲除模型

Phd14基因敲除小鼠復合250 mg/kg葉酸腹腔注射，4周。病理結(jié)果：腎間質(zhì)發(fā)生多灶狀纖維化，伴炎性細胞浸潤，腎小管管腔擴大，上皮細胞萎縮、變性。腎功能：SCr升高1.3～2.6倍，BUN增高1.3～3.2倍。研究表明Phd14基因敲除小鼠腎、肺、肝多器官發(fā)生纖維化。葉酸刺激誘導發(fā)生腎損傷是藥物腎毒性造成急性腎損傷類型，葉酸損傷腎小管上皮細胞，引發(fā)一系列炎癥及免疫反應(yīng)；Phd14基因?qū)w維化起保護作用，敲除后促進纖維化形成。此復合模型誘導腎纖維化比例高，混和因素少[35-36]。

3.2　單側(cè)腎切除合Ang Ⅱ模型

切除整個左腎，1周后行微滲透泵置入手術(shù)，灌注Ang Ⅱ，共4周。病理表現(xiàn)：近曲小管上皮細胞渾濁腫大，間質(zhì)炎性細胞廣泛浸潤及膠原纖維顯著增多。腎功能：SCr升高約1.3倍，BUN升高1.2倍左右。尿蛋白增高約6倍[37]。本方法中灌注外源性 Ang Ⅱ，引起小鼠血壓上升，切除單側(cè)腎，則高血壓作用在孤立腎上，增加腎損傷，因此縮短成模時間，同時加重纖維化的程度，可用于原發(fā)性高血壓腎病的研究。

4　轉(zhuǎn)基因模型—KIM-1rec-tg小鼠模型

腎損傷因子-1 (KIM-1)由甲肝病毒受體-1 (HAVCR-1) 基因編碼。正常腎幾乎不產(chǎn)生 KIM- l蛋白，研究發(fā)現(xiàn)，KIM- l的持續(xù)表達是急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)轉(zhuǎn)化為慢性腎病 (chronic kidney disease，CKD) 的生物學標志，與腎間質(zhì)纖維化程度高度相關(guān)。用Cre/Loxp系統(tǒng)位點重組酶能夠復制出在腎小管上皮細胞中特異性表達KIM-1蛋白的小鼠模型KIM-1rec-tg。

造模方法：復制腎小管上皮細胞內(nèi)特異性表達KIM-1的轉(zhuǎn)基因KIM-1rec-tg小鼠，共4周。KIM- lrec- tg小鼠發(fā)生進行性加重的自發(fā)性腎間質(zhì)損傷與間質(zhì)纖維化，最終發(fā)展成慢性腎衰(chronic renal failure，CRF)，同時合并 CKD發(fā)展的多種并發(fā)癥，如貧血、低蛋白血癥、電解質(zhì)紊亂、心血管病等?？梢宰鳛槿娣磻?yīng)人類CKD疾病表型的動物模型[38-39]。

5　結(jié)語

腎纖維化模型種類比較多，各方法均有優(yōu)缺點。藥物毒性腎損傷模型，造模方法簡便，但用藥劑量不等，同一模型，造模時間也有較大懸殊，且易出現(xiàn)其他器官的損害，病變不均一。手術(shù)模型雖然有出血、感染的困擾，但模型病變單一，且方法簡便，成模時間短，應(yīng)用比較多。復合模型符合臨床疾病復雜性的特點，成模較快，但造模的過程繁瑣。轉(zhuǎn)基因模型費用昂貴，是其應(yīng)用受限的主要原因。

實際上，腎纖維化的發(fā)生受多因素的共同影響，單一因素的動物模型不能完整模擬其病理機制。目前的模型雖然有各種缺點，但在病因方面已完善對腎纖維化發(fā)生的認識。以后隨著理想模型的創(chuàng)造，將促進對腎纖維化發(fā)病機制全面的理解及治療藥物的研發(fā)。