胃腺癌組織中人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因和環(huán)氧合酶-2的表達及相關性

劉 亮 張建海 劉江惠 左連富

(河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院腫瘤研究所流式細胞室，河北 石家莊 050011)

在全國惡性腫瘤發(fā)病中胃癌居第二位，僅次于肺癌，同時數(shù)據(jù)顯示，全國惡性腫瘤死亡第一位是肺癌，其次為肝癌、胃癌〔1〕。惡性腫瘤生長具有無控性旺盛增殖能力，表現(xiàn)出細胞增殖旺盛。細胞增殖周期紊亂與腫瘤發(fā)生密切相關，對細胞癌變發(fā)生及發(fā)展具有至關重要的作用〔2，3〕。細胞周期調(diào)控是復雜的機制，多基因、多途徑參與調(diào)控。人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因(PTEN)又稱為多種進展期癌突變基因(MMAC)1或轉化生長因子調(diào)節(jié)的上皮細胞富含的磷酸酶(TEP)1，具有磷酸酯酶活性，可通過拮抗酪氨酸激酶等磷酸化酶的活性而抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展。PTEN對細胞周期起著負性調(diào)節(jié)作用〔4〕，可抑制細胞周期從G1向S過渡，抑制細胞增殖〔5〕。環(huán)氧合酶(COX)-2又稱為前列腺素類過氧化物合成酶，是前列腺素合成的重要限速酶。研究顯示，COX-2在多種惡性腫瘤細胞中高表達，且在調(diào)控細胞周期〔6〕、免疫力〔7〕及細胞凋亡〔8〕等方面起著重要的作用。本文檢測不同胃病變組織中PTEN、COX-2及細胞增殖周期表達及其相互調(diào)控與胃癌發(fā)生、發(fā)展的關系。

1 材料與方法

1.1一般資料 河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院病理科2010年2月至2012年2月手術切除胃癌標本60例(中、高分化腺癌38例，低分化腺癌22例)，同時取癌旁組織(距腫瘤1～2 cm)60例，均有完整的病理資料。從癌旁組織中經(jīng)蘇木精-伊紅(HE)染色篩選慢性萎縮性胃炎18例，胃黏膜上皮不典型增生42例(輕度不典型增生18例，中、重度不典型增生24例)；另取60例正常胃黏膜作為正常對照(標本均取自非惡性腫瘤患者的胃黏膜)，其病理證實均為正常胃黏膜組織。標本均經(jīng)70%酒精固定，4℃冰箱保存。

1.2儀器及試劑 鼠抗人PTEN抗體及兔抗人COX-2抗體均購自美國Santa Cruz公司；異硫氰酸熒光素(FITC)標記羊抗鼠免疫球蛋白(Ig)G二抗及FITC標記羊抗兔IgG二抗購自美國Jackson Immuno Research；碘化丙啶染料購自美國sigma公司；Epics-XLⅡ型流式細胞儀，美國Beckman Coulter公司。

1.3單細胞懸液樣品的制備 流式細胞儀檢測的樣品需要合格的單細胞懸液，不同病變胃組織單細胞懸液制備使用機械法中的網(wǎng)搓法〔9〕，將制備的單細胞懸液使用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細胞2次，對細胞懸液計數(shù)，調(diào)整細胞濃度為1×107/ml，備用。

1.4流式細胞術檢測細胞中PTEN及COX-2蛋白的免疫熒光標記 將上述制備的單細胞懸液微渦旋震蕩混勻后，取細胞懸液100 μl，放入流式細胞儀上樣管中，分別加入1∶100稀釋的PTEN或COX-2 抗體100 μl，室溫放置30 min，PBS洗滌細胞2次，棄上清，分別加入羊抗鼠或羊抗兔FITC-IgG二抗工作液100 μl，室溫避光放置30 min，PBS洗滌細胞2次，加入1.0 ml PBS懸浮細胞，經(jīng)300目尼龍網(wǎng)過濾細胞后上流式細胞儀檢測。流式細胞術檢測細胞平均熒光強度代表細胞蛋白表達量。

1.5流式細胞術檢測細胞增殖周期 將上述制備的單細胞懸液微渦旋震蕩混勻后，取細胞懸液100 μl，放入流式細胞儀上樣管中，加入碘化丙啶染液(50 μg/ml)1 ml，在4℃溫度下避光染色30 min，PBS洗滌細胞2次，300目尼龍網(wǎng)過濾后上流式細胞儀檢測。細胞增殖狀態(tài)以增殖指數(shù)(PI)表示，增殖指數(shù)(PI)=(S+G2/M)÷(G0/1+ S+G2/M)×100%。

1.6統(tǒng)計學方法 應用SPSS11.5軟件進行方差分析，LSD-t檢驗，t檢驗，Pearson相關分析。

2 結 果

2.1不同胃病變組織細胞PI 胃腺癌細胞PI〔(33.65±7.01)%〕顯著高于胃正常組織〔(17.35±5.44)%〕、萎縮性胃炎〔(18.42±4.53)%〕及胃不典型增生組織〔(23.42±6.43)%,均P<0.01〕，且不典型增生細胞PI顯著高于胃正常組織及萎縮性胃炎(P<0.01)，但胃正常組織與萎縮性胃炎無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.2不同胃病變組織PTEN蛋白表達水平 胃腺癌中PTEN蛋白表達水平(325.62±37.53)顯著低于胃正常組織(365.64±28.58)、萎縮性胃炎(364.60±28.15)及胃不典型增生組織(356.56±23.22，均P<0.01)。胃不典型增生及萎縮性胃炎組織PTEN蛋白表達水平與胃正常組織無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.3不同胃病變組織中COX-2蛋白表達 胃腺癌中COX-2蛋白表達(316.17±25.83)顯著高于胃正常組織(257.06±29.91)、萎縮性胃炎(261.37±26.29)及胃不典型增生組織(267.18±36.25，均P<0.01)。不典型增生及萎縮性胃炎組織中COX-2蛋白表達水平與正常組織無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.4不同分化程度胃腺癌組織中PTEN及COX-2蛋白表達 中、高分化的胃腺癌組織中PTEN蛋白表達(323.53±41.36)與低分化胃腺癌組織(329.23±30.36)無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；中、高分化的胃腺癌組織中COX-2蛋白表達(318.83±29.52)與低分化胃腺癌組織(311.59±17.43)無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.5胃腺癌細胞PI與PTEN及COX-2蛋白表達的相關性 胃腺癌細胞PI與PTEN蛋白表達呈顯著負相關(r=-0.28，P=0.03)，與COX-2蛋白表達無顯著相關性(r=0.14，P=0.29)。

3 討 論

惡性腫瘤細胞呈現(xiàn)旺盛增殖能力，細胞周期紊亂可導致腫瘤的發(fā)生及發(fā)展。細胞周期調(diào)控由多因素多步驟參與。細胞周期調(diào)控關鍵點包括，G1期向S期過渡、S期向G2期過渡調(diào)控。PTEN對細胞周期具有負性調(diào)節(jié)作用，可以抑制細胞周期的G1向S期進程，其具有磷酸酯酶活性，可通過拮抗酪氨酸激酶等磷酸化酶的活性而抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展，當其功能完全或部分喪失可能導致腫瘤細胞惡性表型的過度表達，因此PTEN被認為是抑癌基因〔10〕。PTEN能抑制細胞的不正常增殖分裂，參與細胞生長調(diào)節(jié)〔11〕，并在腫瘤細胞浸潤、血管發(fā)生及腫瘤轉移中起到一定作用。本文顯示胃癌細胞具有旺盛的增殖能力，細胞增殖周期的紊亂參與了胃癌的早期發(fā)生。PTEN蛋白表達降低與胃腺癌細胞PI增高有關。本文檢測到PTEN蛋白結果與張建?！?2〕檢測的結果相一致，本文在其實驗基礎上增加了樣本例數(shù)并與細胞PI進行了對比。

COX-2是前列腺素生物合成過程中的一個重要限速酶，可將花生四烯酸代謝為各種前列腺素產(chǎn)物，從而維持機體的病理生理過程。研究顯示，COX-2與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關〔13～16〕，具體表現(xiàn)為COX-2可能導致突變發(fā)生，COX-2抑制細胞凋亡、促進細胞黏附，延長細胞周期G1期，降低細胞周期蛋白D1表達，使細胞不能進入分裂，促進腫瘤浸潤轉移能力并降低免疫功能。本文結果提示COX-2可能通過細胞周期以外的其他機制參與了胃腺癌的發(fā)生及發(fā)展。

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