貓ω干擾素研究進(jìn)展

孫明潔，董國(guó)英，張雪竹，胡桂學(xué)*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)春 130118;2.北京師范大學(xué) 全球變化與地球系統(tǒng)科學(xué)研究院，北京100875)

干擾素(Interferon,IFN)是一種由同屬動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生，具有抗病毒作用的分泌性糖蛋白。IFN的活性作用主要受機(jī)體細(xì)胞基因組的調(diào)控，是具有病毒防御、細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡調(diào)節(jié)以及免疫激活等多功能的蛋白。IFN家族的細(xì)胞因子，目前被認(rèn)為是先天免疫反應(yīng)的重要組成部分，也是病毒感染的第一道防線[1]。IFN因在抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤等方面具有較好的效果被視為人和動(dòng)物某些疾病和病毒感染的首選治療性藥物。1957年由Lsaacs和Lindenmann首次發(fā)現(xiàn)了可以干擾病毒復(fù)制的生物活性物質(zhì)，后命名為IFN。根據(jù)與受體相結(jié)合的方式將其分為I型、II型和III型，I型干擾素包括IFN-α、IFN-β、IFN-ε、IFN-ω、IFN-κ、IFN-δ、IFN-τ和IFN-ζ，他們可通過(guò)相同的受體(干擾素-α/β受體1 [IFNAR1]和IFNAR2)發(fā)揮一定的生物活性。Ⅱ型IFN中僅有IFN-γ亞型，由T淋巴細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞產(chǎn)生并對(duì)被感染的細(xì)胞進(jìn)行識(shí)別后作出一系列的免疫反應(yīng)。Ⅲ型IFN 分為IFN-λ1、IFN-λ2和IFN-λ3，通過(guò)使用特殊的受體復(fù)合物來(lái)調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫應(yīng)答[2-3]。

1985年，干擾素ω首次從仙臺(tái)病毒誘導(dǎo)的Namalwa細(xì)胞中克隆得到[4]。IFN-ω除了具有與Ⅰ型干擾素類(lèi)似的結(jié)構(gòu)外，還存在相同的理化特性，如對(duì)胰蛋白酶和溫度的高敏感性，以及在酸性條件下的pH 穩(wěn)定性[5]。自IFN-ω被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，因其種屬特異性及更高效的抗病毒活性，一直是國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)?，F(xiàn)已鑒定出在貓科、豬、馬、兔子、蝙蝠、牛和羊中均存在IFN-ω，犬和小鼠體內(nèi)并未發(fā)現(xiàn)[6]。1992年，貓干擾素基因被Nakamura分離得到，一年后在貓IFN-ω基礎(chǔ)上的重組干擾素藥物研制成功并在日本上市，主要用于治療貓杯狀病毒及犬細(xì)小病毒病。有學(xué)者還針對(duì)FeIFN-α與FeIFN-ω的抗病毒活性進(jìn)行比較研究，就H9N2亞型禽流感病毒(AIV)和犬瘟熱病毒(CDV)兩種病毒而言，F(xiàn)eIFN-ω的抗病毒活性比FeIFN-α高160倍和4倍[6]。近20年來(lái)，對(duì)于貓IFN-ω的研究雖已開(kāi)展，但其研究的深度和廣度仍比較有限，且難以廣泛應(yīng)用于臨床治療。鑒于貓IFN-ω所顯示出高效、廣譜的抗病毒能力，探索貓IFN-ω的抗病毒作用機(jī)制及其對(duì)貓病毒病在實(shí)際治療上的深入研究至關(guān)重要。本文結(jié)合IFN-ω的相關(guān)研究成果對(duì)貓ω干擾素的結(jié)構(gòu)特征、生物學(xué)活性及其臨床上的應(yīng)用進(jìn)行綜述，以期為臨床上貓及其他動(dòng)物病毒病的干擾素治療提供參考。

1 貓ω干擾素(FeIFN-ω)的結(jié)構(gòu)特征

FeIFN-ω的基因結(jié)構(gòu)與其他分泌蛋白基本相同，可分為5’端編碼區(qū)、信號(hào)肽編碼區(qū)、成熟肽編碼區(qū)和3’端非編碼區(qū)。其中5’端非編碼區(qū)中含有與基因轉(zhuǎn)錄的起始、調(diào)控與識(shí)別有關(guān)的序列。不同干擾素信號(hào)肽數(shù)目不同，F(xiàn)eIFN-ω中含有來(lái)自殘基1～23的氨基末端分泌信號(hào)序列[7]。其作用是利用疏水性，使干擾素前體與細(xì)胞膜結(jié)合，最終將成熟的干擾素分泌至細(xì)胞外。綜合其他IFN-ω的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，F(xiàn)eIFN-ω基因結(jié)構(gòu)中無(wú)內(nèi)含子和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，且缺乏最終保守密碼子，即139位脯氨酸密碼子。含有幾個(gè)保守的與生物活性至關(guān)重要的殘基，如161位的精氨酸，1、99和100位的半胱氨酸殘基，7個(gè)脯氨酸(4個(gè)位于成熟蛋白的4、26、39和117)[8]。與其他哺乳動(dòng)物不同的是，F(xiàn)eIFN-ω的13個(gè)亞型中，均沒(méi)有N-糖基化識(shí)別位點(diǎn)。FeIFN-α與FeIFN-ω的同源性為94%，雖然兩者之間的同源性很高，但它們之間的抗病毒、抗增殖以及免疫調(diào)節(jié)的活性存在著巨大差異，這可能與FeIFN-ω在C端含有6個(gè)額外保守氨基酸序列，除此之外，在FeIFN-ω2和FeIFN-ω4亞型中的109位有7個(gè)新的氨基酸的插入，插入位置與FeIFN-α相同，這使得FeIFN-ω具有比其他亞型更有效的抗病毒活性[9-10]。

2 FeIFN-ω的生物學(xué)活性

2.1 FeIFN-ω抗病毒作用機(jī)制 正常細(xì)胞中，IFN基因及其復(fù)制酶系統(tǒng)處于抑制狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞感染病毒后，細(xì)胞自身產(chǎn)生特殊因子，可以與IFN基因抑制物相結(jié)合，IFN基因抑制狀態(tài)解除，產(chǎn)生的IFN首先與特定的細(xì)胞表面受體相互作用，后誘導(dǎo)IFN刺激基因(ISGs)的表達(dá)，其中一些如信號(hào)蛋白、轉(zhuǎn)錄因子和凋亡蛋白等可以編碼抗病毒的效應(yīng)物或者趨化因子，可以進(jìn)一步調(diào)控IFN的信號(hào)傳導(dǎo)，IFN-ω還可以誘導(dǎo)MX1、ISG15、IFIT3和ISG56基因的轉(zhuǎn)錄[11]。通過(guò)干擾素介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)激活I(lǐng)型干擾素的主要通路—JAK-STAT通路，進(jìn)一步誘導(dǎo)抗病毒蛋白的產(chǎn)生，達(dá)到破壞病毒增殖的目的。抗病毒系統(tǒng)主要分為三種，2'-5'寡腺苷酸合成酶/RNaseL系統(tǒng)：該系統(tǒng)包含2'-5'寡腺苷酸合成酶、RNA酶L、2'-5'腺苷磷酸二酯酶三種獨(dú)立的酶，病毒源的dsRNA可導(dǎo)致RNaseL的活化，RNaseL可降解單鏈RNA，從而抑制以RNA作為中介的病毒復(fù)制，2'-5'寡腺苷酸二酯酶通過(guò)催化2'-5'寡腺苷酸的降解調(diào)節(jié)整個(gè)抗病毒過(guò)程；MX系統(tǒng)：可在轉(zhuǎn)錄水平通過(guò)干擾病毒聚合酶活性，干擾負(fù)鏈病毒的復(fù)制，其具體機(jī)理尚不完全清楚；PKR系統(tǒng)：PKR的基因表達(dá)是IFN通過(guò)刺激啟動(dòng)子區(qū)ISRE與GAS介導(dǎo)完成的。PKR的氨基末端的2個(gè)保守的dsRNA結(jié)合位點(diǎn)，能導(dǎo)致PKR的構(gòu)像結(jié)構(gòu)改變，從而激活酶活性，迅速刺激PKR基因的表達(dá)，達(dá)到抗病毒作用[12]。總之，IFN-ω發(fā)揮抗病毒作用，主要是通過(guò)抗病毒基因表達(dá)使細(xì)胞達(dá)到破壞病毒增殖的狀態(tài)達(dá)成的。

Ⅰ型干擾素受體(IFNR)在抗病毒作用機(jī)制中，也起著至關(guān)重要的作用。所有Ⅰ型IFN只與IFNR結(jié)合，相互競(jìng)爭(zhēng)IFNR上的結(jié)合位點(diǎn)，不同的IFN-IFNR復(fù)合物會(huì)啟動(dòng)不同的信號(hào)傳導(dǎo)途徑。有研究表明feIFN-α與 feIFN-ω在IFNAR2上有不同的結(jié)合位點(diǎn)，且feIFN-ω與IFNAR2的相對(duì)親和力更高，這表明抗病毒活性可能與IFN與IFNR間的親和力有關(guān)[13]。

2.2 調(diào)節(jié)先天免疫反應(yīng) 有證據(jù)表明FeIFN-ω可能與非特異性免疫反應(yīng)有關(guān)，可使急性期蛋白(血清淀粉樣蛋白-A、α-1糖蛋白和C反應(yīng)蛋白)的存活時(shí)間增長(zhǎng)，巨噬細(xì)胞的吞噬活性及自然殺傷細(xì)胞的活性均增加，機(jī)體病毒的排泄量減少[14]。同時(shí)增加的ISG、Mx蛋白和ZAPS的數(shù)量，增強(qiáng)先天免疫信號(hào)傳導(dǎo)，這一系列的變化表明IFN-ω可以引發(fā)機(jī)體的先天免疫反應(yīng)，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞對(duì)抗原的吞噬能力。Leal等用IFN-ω處理細(xì)胞后，Mx-1、ISG15、IFIT3和ISG56因子的表達(dá)量均呈上升趨勢(shì)[15]。用重組貓IFN-ω(rFeIFN-ω)通過(guò)皮下注射或口服的方式處理感染貓免疫缺陷病毒(FIV)實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物，結(jié)果顯示rFeIFN-ω可以顯著影響IL-6的產(chǎn)生。皮下注射組動(dòng)物體內(nèi)IL-6血漿水平降低，原病毒載量增加，而口服組中IL-6 mRNA表達(dá)量降低。然而，該療法對(duì)已達(dá)到病毒血癥期的動(dòng)物及其他細(xì)胞因子(IL-1、IL-4、IL-10、IL-12P40、IFN-γ和腫瘤壞死因子-α)的表達(dá)沒(méi)有影響[15]。因此，F(xiàn)eIFN-ω可以參與先天免疫，并且可以進(jìn)一步抑制病毒復(fù)制并發(fā)揮其抗病毒活性，但其具體的調(diào)控方式尚未明確，有待進(jìn)一步研究。

2.3 抗增殖和抗腫瘤活性 大量動(dòng)物試驗(yàn)表明，IFNs具有誘導(dǎo)細(xì)胞分裂周期停滯和細(xì)胞凋亡的抗細(xì)胞增殖作用，該作用可從一個(gè)細(xì)胞向臨近的細(xì)胞移動(dòng)，從而達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的作用[16]。IFNs還可以直接抑制自身惡性細(xì)胞增殖，或者通過(guò)間接調(diào)節(jié)細(xì)胞毒效應(yīng)細(xì)胞，達(dá)到抗腫瘤效應(yīng)。當(dāng)rFeIFN-ω用于治療貓乳腺癌細(xì)胞時(shí)，呈現(xiàn)出了劑量依賴(lài)性、物種特異性以及靶細(xì)胞特異性，且可以與其他常規(guī)抗癌藥物共同作用，可以更好的發(fā)揮藥性。該研究證明，rFeIFN-ω有著出色的抗腫瘤活性，具有可以成為貓乳腺癌首選治療藥物的潛質(zhì)[17]。

3 rFeIFN-ω的臨床應(yīng)用

隨著進(jìn)一步研究，探索出更多FeIFN-ω及rFeIFN-ω在臨床上還可以治療的其他種屬動(dòng)物病毒性疾病迫在眉睫。有研究將FeIFN-ω序列與桿狀病毒載體構(gòu)建出的重組質(zhì)粒在家蠶幼蟲(chóng)中表達(dá)，所制成的rFeIFN-ω作為免疫調(diào)節(jié)劑已在日本和澳大利亞等國(guó)用于治療貓細(xì)小病毒(FeLV)、犬細(xì)小病毒(CPV)及和貓免疫缺陷病(FIV)。有實(shí)驗(yàn)證明該重組干擾素還可用于治療貓杯狀病毒(FCV)和貓皰疹病毒-1(FHV-1)，且可獲得較好的療效[18]。rFeIFN-ω的治療可分為三個(gè)療程，每天5次皮下注射(1 MU/kg)，分別從第0、14和60天開(kāi)始進(jìn)行治療[19]。 然而，由于該治療方案相對(duì)昂貴耗時(shí)，且皮下給藥伴有一些輕微的如發(fā)燒、嗜睡、腹瀉和嘔吐等不良反應(yīng)使其在臨床上的進(jìn)一步推廣受到了限制。目前有研究提出可以用口服或粘膜給藥的方式替代皮下注射，解決了皮下注射產(chǎn)生的副作用，這一研究使rFeIFN-ω在獸醫(yī)臨床中的應(yīng)用成為可能，但如何更好的增強(qiáng)rFeIFN-ω的治療效果、降低的生產(chǎn)成本，成為未來(lái)研究的新方向。

4 FeIFN-ω及rFeIFN-ω對(duì)常見(jiàn)貓病毒病影響的研究

FCV是貓常見(jiàn)病原體，可導(dǎo)致口腔潰瘍或上呼吸道疾病，嚴(yán)重時(shí)引發(fā)致命性全身性疾病。目前仍然沒(méi)有可以直接用于治療FCV的抗病毒藥物。Lee等通過(guò)研究證明，紅參提取物或者人參皂苷可以使IFN-ω、Mx等細(xì)胞因子的相對(duì)表達(dá)量顯著上升，以此來(lái)抑制FCV病毒的復(fù)制，達(dá)到免疫效果[20-21]。rFeIFN-ω對(duì)FCV陽(yáng)性貓也具有一定的治療效果，有研究利用rFeIFN-ω對(duì)160只陽(yáng)性貓進(jìn)行治療，靜脈注射2.5或5 MU/kg rFelFN-ω每日3次，7 d內(nèi)觀察其臨床癥狀有所改善，幼貓無(wú)法進(jìn)食的現(xiàn)象有所緩解。部分研究證明，rFelFN-ω也可以通過(guò)抑制FHV-1的復(fù)制達(dá)到治療效果。一項(xiàng)研究中，用注射劑量為0.5 μm/mL的FelFN-ω對(duì)20只感染FHV-1的幼貓進(jìn)行治療，3周后觀察眼部癥狀明顯緩解。但在2007年巴林等的研究中，用rFelFN-ω對(duì)貓進(jìn)行治療，7 d后實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物的急性病毒性上呼吸道疾病的臨床癥狀并沒(méi)有得到改善[22]。因此，還需要更多研究來(lái)驗(yàn)證rFIFN-ω在體內(nèi)有治療FHV-1的作用。

FeLV屬于內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒，可引起多種免疫抑制性疾病，如嚴(yán)重厭食癥、缺鈣和漸進(jìn)性虛弱[23]。有研究用rFelFN-ω處理被FeLv感染的FL74細(xì)胞，評(píng)估細(xì)胞感染病毒顆粒的數(shù)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)rFelFN-ω降低了逆轉(zhuǎn)錄酶的活性[24]，這表明rFelFN-ω可以通過(guò)影響FeLV的轉(zhuǎn)錄來(lái)抑制病毒增殖，并增加了感染細(xì)胞中細(xì)胞凋亡和死亡率，從而達(dá)到治療效果[25]。同屬貓免疫系統(tǒng)疾病的FIV是一種貓慢性病毒，于1987年首次發(fā)現(xiàn)，其基因組結(jié)構(gòu)與人類(lèi)艾滋病病毒相似。全球大約有7%的貓存在同時(shí)感染FeLV與FIV的現(xiàn)象[26]。rFeIFN-ω可顯著降低感染貓的臨床評(píng)分和死亡率，并改善異常血液學(xué)參數(shù)(紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、紅細(xì)胞壓積和白細(xì)胞計(jì)數(shù))，口服rFelFN-ω也可使感染FIV的貓臨床癥狀得到改善，雖然機(jī)體內(nèi)的病毒載量并沒(méi)有顯著變化，但仍可證明口服rFeIFN-ω可使機(jī)體獲得有效的免疫調(diào)節(jié)，可能成為治療FIV病毒的有效替代藥物[27]。

貓慢性齦口炎綜合征(FCGS)是一種多因素誘發(fā)疾病。Hennet等研究表明，口服rFeIFN-ω可有效緩解FCGS的尾部造口性牙髓炎及牙齦炎等臨床癥狀，相比于常規(guī)皮質(zhì)類(lèi)固醇具有更好的鎮(zhèn)痛效果。同時(shí)它對(duì)患有FCGS的II型糖尿病貓也有一定效果，口腔癥狀及所需的胰島素劑量與干擾素的治療劑量呈正相關(guān)，與Hennet等的研究結(jié)果一致，表明口服干擾素可以總體緩解FCGS所造成的疼痛感[28]。貓傳染性腹膜炎(FIP)是一種由貓冠狀病毒引起的免疫介導(dǎo)疾病[29]。有研究顯示，12只疑感染FIP的貓，每隔1 d用106U/kg的FeIFN-ω治療，癥狀緩解后，改為每周注射1次，經(jīng)治療后其中有4只壽命超過(guò)兩年。Ritz等在進(jìn)行的后續(xù)研究中，增加了空白對(duì)照組，但干擾素組與對(duì)照組治療的貓的存活時(shí)間之間沒(méi)有明顯差異，但 FeIFN-ω治療組淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯降低，F(xiàn)eIFN-ω組的1只貓存活>3個(gè)月。這些結(jié)果表明，F(xiàn)eIFN-ω也可能治療FIP但劑量和免疫途徑還有待進(jìn)一步研究[30]。

5 結(jié) 語(yǔ)

干擾素是所有抗病毒藥物中最為廣譜、高效、生物學(xué)活性廣泛的特效治療性藥物。除了抗病毒、抗增殖和抗腫瘤作用外，還具有可以刺激多種免疫細(xì)胞如NK細(xì)胞、T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的產(chǎn)生，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡基因的表達(dá)以及調(diào)節(jié)細(xì)分化的特點(diǎn)，其制劑的毒性和副作用較低，具有極大的研究及推廣潛力。目前已知的FeIFN-ω及其基因工程制品，在臨床中僅被注冊(cè)用于治療FeLV和FIV感染，但已有實(shí)驗(yàn)證明，其在治療其他病毒感染或疾病如：FCV、FHV-1、FIV、FCGS及FIP時(shí)仍有著相當(dāng)大的治療效果，且療效優(yōu)于當(dāng)前普遍臨床用FeIFN-α。因此，進(jìn)一步對(duì)FeIFN-ω的調(diào)控機(jī)制、生物學(xué)活性、貓?jiān)床《炯捌渌N屬病毒的抗病毒活性的探索至關(guān)重要。

雖然，它還存在著長(zhǎng)期注射治療導(dǎo)致治療成本高昂，副作用大，且在高劑量使用時(shí)的安全性仍待研究證實(shí)等缺陷，但諸多優(yōu)點(diǎn)使其仍擁有巨大的臨床應(yīng)用價(jià)值?？傊?，F(xiàn)eIFN-ω的進(jìn)一步研究對(duì)貓及其他各類(lèi)動(dòng)物疾病的預(yù)防與治療發(fā)揮重要的作用，相信不久的將來(lái)價(jià)格低廉的干擾素將在臨床上得以廣泛的應(yīng)用。