氟苯尼考注射液在雞體內(nèi)殘留消除研究

宋志超，張崇威，陳 薔，朱 雷，邱富娜，吳寧鵬，吳志明

(河南省獸藥飼料監(jiān)察所，鄭州 450008)

氟苯尼考屬動(dòng)物專用氯霉素類廣譜抗菌藥物，由美國(guó)Schering-Plough公司于1988年研制成功，并在1999年被我國(guó)批準(zhǔn)為國(guó)家二類新獸藥[1]。因其吸收好、體內(nèi)分布廣、安全高效，并且無(wú)再生障礙性貧血的特點(diǎn)，氟苯尼考被廣泛用于治療豬、禽、牛及水產(chǎn)等養(yǎng)殖動(dòng)物的細(xì)菌性疾病[2-4],但氟苯尼考對(duì)哺乳動(dòng)物具有胚胎毒性，人體用藥后還出現(xiàn)厭食、腹瀉等不良反應(yīng)，長(zhǎng)期食用含有氟苯尼考及其代謝物的動(dòng)物源食品將會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生嚴(yán)重的安全隱患[5]。因此，嚴(yán)格控制動(dòng)物源食品中氟苯尼考?xì)埩袅?、合理制定氟苯尼考休藥期就顯得尤為重要。

本實(shí)驗(yàn)以自制10 mL∶0.5 g氟苯尼考注射液為研究對(duì)象，按照《中國(guó)獸藥典(2015年版)》獸藥制劑品種說(shuō)明書(shū)范本中有關(guān)氟苯尼考注射液的規(guī)定給藥，并建立氟苯尼考及氟苯尼考胺的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法。對(duì)各個(gè)組織中的氟苯尼考及代謝物氟苯尼考胺進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算相應(yīng)休藥期，為正確用藥提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 5%氟苯尼考注射液：自制。氟苯尼考對(duì)照品：含量99.3%，批號(hào)K0301305，中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供；氟苯尼考氘代物對(duì)照品：含量98.0%,批號(hào)F405751，TRC公司；氟苯尼考胺對(duì)照品：含量99.1%，批號(hào)262329，Witega公司提供；氟苯尼考氘代物：含量98.0%，批號(hào)21-SHG-115-1，TRC公司提供；甲醇、乙腈為色譜純；氨水25%～28%；乙酸乙酯、無(wú)水硫酸銨、甲酸銨、氯化鈉、正己烷為分析純。

1.2 儀器設(shè)備 Waters Acquity UPLC-Xevo TQ-S液質(zhì)聯(lián)用儀(配電噴霧離子源)；高速冷凍離心機(jī)；氮吹儀；分析天平；Milli-Q超純水儀。

1.3 溶液配制 2%氨化乙酸乙酯：取氨水20 mL，加乙酸乙酯980 mL，混勻；4%氯化鈉溶液：取氯化鈉4 g，用水溶解并稀釋至100 mL；4%氯化鈉溶液飽和的正己烷：取一定量4%氯化鈉溶液，加入過(guò)量的正己烷，混合，靜止分層；20%甲醇溶液：取甲醇20 mL，加水80 mL，混勻；10 mmol/L甲酸銨溶液：取甲酸銨0.63 g，用水溶解并稀釋至1000 mL。

1.4 試驗(yàn)動(dòng)物 白羽雞35只，體重2.5±0.5 kg，購(gòu)于河南大用實(shí)業(yè)有限公司。給藥組30只，公母各半，對(duì)照組5只，公雞3只，母雞2只。試驗(yàn)前預(yù)飼養(yǎng)1周，期間不給任何抗菌藥物，試驗(yàn)前后各組飼養(yǎng)條件相同。

1.5 給藥與樣本采集 給藥組按照20 mg/kg(按氟苯尼考計(jì))，肌內(nèi)注射，每隔48 h給藥1次，連用2次，并于最后一次給藥0(6 h)、1、3、5、7 d分別隨機(jī)宰殺6只(給藥組)及1只(空白對(duì)照組)，采集胸脯雞肉(非注射部位)、雞全肝、雞全腎、雞皮脂，做好標(biāo)記，于-20 ℃保存。

1.6 試驗(yàn)方法 本研究根據(jù)具體情況，采用實(shí)驗(yàn)室自建殘留檢測(cè)方法對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)定，內(nèi)標(biāo)法定量[6]。

1.6.1 樣品前處理 稱取試樣(2±0.02)g，置于50 mL塑料離心管，添加氟苯尼考及氟苯尼考胺混合內(nèi)標(biāo)工作液(50 μg/mL)100 μL，加2%乙酸乙酯-氨水溶液10 mL，渦旋混勻，渦旋振蕩10 min，8000 r/min離心10 min，取上清液于另一離心管中；殘?jiān)?%乙酸乙酯-氨水溶液10 mL重復(fù)提取一次，合并上清液，于50 ℃水浴氮?dú)獯蹈伞?/p>

在殘留物中加入4%氯化鈉溶液3 mL，渦旋使溶解，再加入4%氯化鈉溶液飽和的正己烷5 mL，渦旋混合30 s，8000 r/min離心5 min，棄去正己烷，用5 mL 4%氯化鈉溶液飽和正己烷重復(fù)脫脂一次。在下層水相中加入2%乙酸乙酯-氨水溶液5 mL，渦旋振蕩5 min，8000 r/min離心5 min，吸取上層有機(jī)相于10 mL離心管中，殘?jiān)?%乙酸乙酯-氨水溶液5 mL重復(fù)萃取一次，合并有機(jī)相，50 ℃水浴吹干，殘?jiān)尤?0%甲醇溶液1.0 mL，渦旋混勻，過(guò)0.22 μm濾膜供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定。

1.6.2 液相色譜參考條件 色譜柱：C18柱，2.1×100 mm，粒徑1.7 μm，或相當(dāng)者；流動(dòng)相A：乙腈，B：水(氟苯尼考及氟苯尼考氘代物)/10 mmol/L的甲酸銨溶液(氟苯尼考胺及氟苯尼考胺氘代物)，梯度洗脫程序見(jiàn)表1；30 ℃；進(jìn)樣量5 μL。

表1 梯度洗脫條件Tab 1 Procedure of gradient elution

1為即時(shí)變化，6為線性變化

1.6.3 質(zhì)譜參考條件 離子源：電噴霧(ESI)離子源；掃描方式：正離子(氟苯尼考胺及氟苯尼考胺氘代物)，負(fù)離子同時(shí)掃描(氟苯尼考及氟苯尼考氘代物)；檢測(cè)方式：多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)(MRM)；電離電壓：負(fù)離子模式3.0 kV，正離子模式1.5 kV；錐孔電壓：負(fù)離子模式20 V，正離子模式8 V；源溫：150 ℃；脫溶劑氣溫度：500 ℃；錐孔氣流速：150 L/h；脫溶劑氣流速：1000 L/h；定性、定量離子對(duì)、離子源、錐孔電壓和碰撞能量見(jiàn)表2。

表2 定性、定量離子及對(duì)應(yīng)的錐孔電壓和碰撞能量Tab 2 Qualitative and quantitative ion pair，the corresponding cone volt and collision enerey

標(biāo)“*”為定量離子對(duì)

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線 氟苯尼考在0.5～20 μg/L(內(nèi)標(biāo)濃度為5 μg/L)濃度范圍內(nèi)、氟苯尼考胺在0.5～50 μg/L(內(nèi)標(biāo)濃度為5 μg/L)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，其線性方程分別為：y=1.8691x+1.2865和y=0.8570x+0.0166，相關(guān)系數(shù)R分別為0.9991和0.9999，如圖1及圖2。標(biāo)準(zhǔn)溶液和組織中氟苯尼考及氟苯尼考胺色譜圖見(jiàn)圖3及圖4。

2.2 組織中藥物殘留及消除規(guī)律 按照實(shí)驗(yàn)室自建方法對(duì)所采集各組雞肉、雞肝、雞腎、雞皮脂中氟苯尼考及代謝物氟苯尼考胺進(jìn)行檢測(cè)，內(nèi)標(biāo)法定量。不同時(shí)間點(diǎn)各殘留量見(jiàn)表3及表4，殘留消除曲線見(jiàn)圖5、圖6。

圖2 氟苯尼考胺標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig 2 Standard curve of florfenicol amine

圖3 氟苯尼考及氟苯尼考胺混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖Fig 3 Chromatogram of mixed standard solution of florfenicol and florfenicol amine

圖4 雞腎中殘留的氟苯尼考及氟苯尼考胺色譜圖(休藥后第0天)Fig 4 Chromatogram of florfenicol and florfenicol amine residues in chicken kidney (day 0 after withdrawal)

2.3 休藥期計(jì)算 按照農(nóng)業(yè)農(nóng)村部關(guān)于氟苯尼考?xì)埩魳?biāo)示物最大殘留限量[7]和歐盟對(duì)休藥期計(jì)算的有關(guān)規(guī)定，用CVMP制定的統(tǒng)計(jì)方法(雙單側(cè)95%置信區(qū)間)，對(duì)自制5%氟苯尼考注射液在雞組織中休藥期進(jìn)行計(jì)算。氟苯尼考在各組織中的休藥期見(jiàn)表5，殘留消除擬合圖見(jiàn)圖7～圖10。

表3 不同時(shí)間點(diǎn)氟苯尼考及其代謝物氟苯尼考胺在雞各組織中殘留量(μg·kg-1)Tab 3 Residues of florfenicol and its metabolite florfenicol amine in chicken tissues at different time (μg·kg-1)

ND為未檢出

表4 停藥期間氟苯尼考胺及氟苯尼考在各組織中的殘留量Tab 4 Residues of florfenicol amine and florfenicol in various tissues during withdrawal

ND為未檢出

圖5 肌肉、皮脂中氟苯尼考胺的殘留消除曲線Fig 5 Depletion curve of florfenicol amine residue in muscle and sebum

圖6 雞肝、雞腎中氟苯尼考胺的殘留消除曲線Fig 6 Depletion curve of florfenicol amine residue in chicken liver and kidney

組織Tissue 肌肉Muscle肝臟Liver腎臟Kidney皮+脂Sebum休藥期/dWithdrawal period3.412.062.251.47

圖7 氟苯尼考注射液在雞肉中殘留消除擬合圖Fig 7 Fitting diagram of depletion of residue of florfenicol injection in chicken

圖8 氟苯尼考注射液在雞腎中殘留消除擬合圖Fig 8 Fitting diagram of depletion of residue of florfenicol injection in kidney

圖9 氟苯尼考注射液在雞肝中殘留消除擬合圖Fig 9 Fitting diagram of depletion of residue of florfenicol injection in liver

圖10 氟苯尼考注射液在雞皮脂中殘留消除擬合圖Fig 10 Fitting diagram of depletion of residue of florfenicol injection in sebum

如表5、圖7～圖10所示，根據(jù)WT1.4軟件計(jì)算出氟苯尼考在雞肉、肝臟、腎臟、皮脂的休藥期分別為3.14、2.06、2.25、1.47 d。

3 討論與結(jié)論

3.1 檢測(cè)方法 目前，氟苯尼考及代謝物氟苯尼考胺的檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法[8-10]、氣相色譜法[11-12]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[13-14]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[15-16]和酶聯(lián)免疫法[17]等。由于高效液相色譜靈敏度低，氣相色譜、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法需經(jīng)衍生化后方能檢測(cè)，操作繁瑣，酶聯(lián)免疫法準(zhǔn)確度低等缺點(diǎn)均無(wú)法滿足要求，本研究根據(jù)實(shí)驗(yàn)室具體條件，在堿性環(huán)境下使以有機(jī)鹽形式存在的代謝物以有機(jī)分子形式游離出來(lái)，并以毒性較小溶解性較好的乙酸乙酯作為提取溶劑，經(jīng)正己烷脫脂凈化，前處理操作簡(jiǎn)便快捷。采用具有高靈敏度的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)氟苯尼考及氟苯尼考胺進(jìn)行殘留檢測(cè)，同時(shí)考慮到基質(zhì)效應(yīng)對(duì)準(zhǔn)確度的影響，因此，采用內(nèi)標(biāo)法校正，不但使低殘留能被檢測(cè)到，同時(shí)準(zhǔn)確度也大大提高，保證了所得殘留數(shù)據(jù)的可靠性。

3.2 檢測(cè)結(jié)果 如表3，圖5、圖6所示，在停藥后第0天(6 h)，雞肉、腎臟、皮脂中的氟苯尼考胺殘留量達(dá)到最大值，雞肉中為(203.5±40.52)μg/kg，雞腎中為(993.5±190.07)μg/kg，雞皮脂中為(104.15±14.85)μg/kg。雞肝中氟苯尼考胺在停藥后第1天達(dá)到最大值，為(139.18±29.13) μg/kg。雞肉、腎臟、皮脂中的氟苯尼考胺殘留量在停藥后均呈下降趨勢(shì)。停藥后第1天各組織中氟苯尼考胺殘留量均低于農(nóng)業(yè)部公布的MRL。停藥第5天時(shí)肌肉中檢測(cè)不到氟苯尼考胺?？梢?jiàn)，在停藥后第0天及第1天時(shí)，肝臟及腎臟中的氟苯尼考胺殘留量明顯較高，說(shuō)明氟苯尼考主要經(jīng)肝、腎代謝及排泄，在停藥后第1天時(shí)，肉、腎、皮脂中氟苯尼考胺在雞各組織中均低于50 μg/kg，可見(jiàn)其代謝迅速，以上兩點(diǎn)與丁飛[18]及盧運(yùn)戰(zhàn)[19]報(bào)道結(jié)果一致。

3.3 休藥期 有文獻(xiàn)報(bào)道[20]，氟苯尼考?xì)埩粜菟幤谟?jì)算以氟苯尼考及氟苯尼考胺殘留量之和為依據(jù)，以及給藥療程單劑量20 mg/kg(以氟苯尼考計(jì))連續(xù)給藥3 d的情況。本研究按照《中國(guó)獸藥典(2015年版)》獸藥制劑品種說(shuō)明書(shū)范本中有關(guān)氟苯尼考注射液的給藥規(guī)定，以及農(nóng)業(yè)部235公告規(guī)定的氟苯尼考?xì)埩魳?biāo)識(shí)物為氟苯尼考胺的規(guī)定[7]，故本研究給藥量為每次20 mg/kg(以氟苯尼考計(jì))，隔48 h用藥1次，連用2次，在計(jì)算氟苯尼考休藥期時(shí)以氟苯尼考胺的殘留量為依據(jù)。

丁飛[18]以氟苯尼考磺酸鹽注射液按照20 mg/kg對(duì)雞進(jìn)行肌內(nèi)注射，每天1次，連續(xù)給藥3 d，給出推薦休藥期為5 d。與本實(shí)驗(yàn)的以氟苯尼考注射液為研究對(duì)象，給藥劑量20 mg/kg，肌內(nèi)注射，每隔48 h給藥1次，連用2次所計(jì)算出的休藥期略有差異，考慮主要是由于給藥劑量、劑型不同等原因造成。

按照20 mg/kg(按氟苯尼考計(jì))，肌內(nèi)注射，每隔48 h給藥1次，連用2次，建議休藥期為4 d，但考慮到雞各組織內(nèi)同時(shí)存在氟苯尼考及氟苯尼考胺以及其他有害代謝產(chǎn)物，例如氟苯尼考醇和一些未知代謝物形式[21]，給動(dòng)物性產(chǎn)品的質(zhì)量安全帶來(lái)風(fēng)險(xiǎn)。因此，實(shí)際休藥期應(yīng)高于4 d。