UHPLC-Q/TOF MS結(jié)合HPLC-DAD定性和定量分析硫酸黏菌素可溶性粉中的未知添加物

陸春波,包愛(ài)情,周芷錦,張航俊,陳慧華

(浙江省獸藥飼料監(jiān)察所,杭州 311101)

硫酸黏菌素收載于《中國(guó)獸藥典》2010年版[1]，屬于多肽類抗菌藥，是一種堿性陽(yáng)離子表面活性劑，用于防治豬、雞革蘭氏陰性菌所致的腸道感染，如仔豬黃痢、仔豬白痢、仔豬副傷寒、雞白痢、雞大腸桿菌病等[2-3]。磺胺氯達(dá)嗪屬于磺胺類抗菌藥物，甲氧芐啶屬于抗菌增效劑[4]，二者合用可產(chǎn)生協(xié)同作用，增強(qiáng)抗菌效果，對(duì)大多數(shù)革蘭氏陽(yáng)性菌和陰性菌均有較強(qiáng)抑制作用，用于豬、雞大腸桿菌、沙門氏菌和巴氏桿菌等感染，如仔豬白痢、仔豬黃痢、豬肺疫、禽霍亂、雞白痢、雞大腸桿菌病等[5]。硫酸黏菌素和磺胺氯達(dá)嗪的適應(yīng)癥較為相似。目前，為了嚴(yán)厲打擊獸藥制劑中非法添加的狀況，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部頒布了一系列的公告，制訂了硫酸黏菌素制劑中非法添加喹乙醇、乙酰甲喹和阿托品的檢查方法[6-7]。但由于違規(guī)企業(yè)非法添加的手段越來(lái)越隱蔽，技術(shù)越來(lái)越高超，使用法定標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)時(shí)無(wú)法發(fā)現(xiàn)或者難以發(fā)現(xiàn)，僅用已發(fā)布的公告檢查也不能完全覆蓋[8-9]。已報(bào)道的獸藥非法篩查方法主要有液相法[10]和液質(zhì)法[11]。近年來(lái)，采用建立的超高效液相色譜-四級(jí)桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜(UHPLC-Q/TOF MS)的譜庫(kù)，針對(duì)可疑樣品進(jìn)行篩查，發(fā)現(xiàn)疑似添加物，并使用HPLC-DAD法進(jìn)行雙重確證和含量測(cè)定。本文通過(guò)一個(gè)實(shí)際樣品在檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)的異常，提出存在未知添加物的懷疑，使用高分辨質(zhì)譜推斷確證添加物以及液相色譜定量測(cè)定添加物，并對(duì)非法添加的原因進(jìn)行了探討，以期為打擊獸藥非法添加提供理論方法與技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與材料 Agilent 1260高效液相色譜儀，配二極管陣列檢測(cè)器(美國(guó)Agilent公司)；Agilent 1290-6550超高效液相色譜-四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(UHPLC-Q/TOF MS)，(美國(guó)Agilent公司)；超純水機(jī)(美國(guó)Millipore公司)；XS205 分析天平(瑞士Mettler Toledo公司)；KQ-500E超聲儀(昆山市超聲儀有限公司)。

甲醇(色譜純，美國(guó)Merck公司)；甲酸(色譜純，美國(guó)恩科公司)；乙酸銨(分析純，陜西隴化工股份有限公司)；磷酸(分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司)?；前仿冗_(dá)嗪鈉對(duì)照品購(gòu)于中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，含量96.4%(按磺胺氯達(dá)嗪計(jì)為89.5%)，批號(hào)為H0221206；甲氧芐啶對(duì)照品購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院，含量99.9%，批號(hào)為100031-201205。黏菌素標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，每1mg效價(jià)22782單位，批號(hào)為K0271305。硫酸黏菌素可溶性粉(批號(hào)20160602，標(biāo)示規(guī)格10%)為浙江省內(nèi)抽檢樣品。

1.2 試驗(yàn)條件

1.2.1 UHPLC-Q/TOF MS分析 采用十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱(Waters Atlantis,150 mm×3.0 mm,3 μm)；流動(dòng)相A為5 mmol/L乙酸銨的0.1%甲酸水溶液，流動(dòng)相B為5 mmol/L 乙酸銨的0.1%甲酸甲醇溶液，梯度洗脫程序見(jiàn)表1，后運(yùn)行3 min；流速0.5 mL/min；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量2 μL。質(zhì)譜采用ESI源，掃描方式為正離子全掃描(ESI+)，毛細(xì)管電壓4.0 kV，干燥氣流速為15 L/min，溫度為350 ℃；鞘氣流速為12 L/min，溫度為350 ℃。一級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集為全掃描模式，掃描范圍：m/z100～1000 Da；采集速率為1.5 spectra/s。二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集為目標(biāo)離子采集模式(Targeted MS/MS)，掃描范圍：m/z50～1000 Da；采集速率為2.5 spectra/s；碰撞能量為10、20、40 eV。采集數(shù)據(jù)時(shí)使用參比溶液對(duì)儀器質(zhì)量軸進(jìn)行實(shí)時(shí)校正，參比離子為m/z121.0509和m/z922.0098。

1.2.2 HPLC-DAD分析 采用十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱 (Agilent Eclipse XDB, 250 mm×4.6 mm, 5 μm)；流動(dòng)相A為0.1%磷酸溶液，流動(dòng)相B為甲醇，梯度洗脫程序：0～2 min，2%B；2～25 min，2%B～100%B；25～28 min，100%B；28～28.1 min，100%B～2%B；28.1～31min，2%B，流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL，掃描波長(zhǎng)：200～400 nm，記錄230 nm波長(zhǎng)處色譜圖。

表1 梯度洗脫表Tab 1 Gradient elution table

1.3 溶液的制備

1.3.1 供試品溶液 精密稱取硫酸黏菌素可溶性粉0.1 g置100 mL量瓶中，加50%甲醇溶液約80 mL超聲溶解后，用50%甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，作為HPLC-DAD供試品溶液。精密量取上述溶液1 mL置10 mL量瓶中，用50%甲醇溶液稀釋至刻度，作為UHPLC-Q/TOF MS篩查和確證用供試品溶液。

1.3.2 對(duì)照品溶液 分別精密稱取磺胺氯達(dá)嗪鈉、甲氧芐啶對(duì)照品適量，用50%甲醇溶液溶解并定量稀釋制成含磺胺氯達(dá)嗪、甲氧芐啶為50 μg/mL的對(duì)照品溶液，用于HPLC-DAD驗(yàn)證；將上述溶液用50%甲醇溶液稀釋制成100 ng/mL的溶液，作為UHPLC-Q/TOF MS確證用對(duì)照品溶液。

2 結(jié)果與分析

2.1 未知物的發(fā)現(xiàn) 照《中國(guó)獸藥典》2010年版一部對(duì)該樣品按照硫酸黏菌素可溶性粉采用微生物檢定法測(cè)定含量時(shí)，發(fā)現(xiàn)該樣品的抑菌圈為虛圈(圖1)。且薄層色譜鑒別中樣品溶液未顯示與黏菌素標(biāo)準(zhǔn)品溶液相同的斑點(diǎn)(圖2)，因此，懷疑該樣品中可能有其他非法添加物。

2.2 未知物的推斷 使用UHPLC-Q/TOF MS對(duì)該樣品進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集，總離子流圖(total ion chromatogram，TIC)如圖3所示，TIC圖中在5.123和5.549 min有2處較大響應(yīng)，對(duì)響應(yīng)1和響應(yīng)2分別進(jìn)行質(zhì)譜提取，得到m/z291.1452和m/z285.0204兩處響應(yīng)明顯大于其他離子的離子(圖3)，在PCDL(MassHunter Workstation Personal Compound Database and Library)庫(kù)中進(jìn)行匹配，發(fā)現(xiàn)甲氧芐啶的[M+H]+與m/z291.1452匹配，匹配分?jǐn)?shù)為98.26，磺胺氯達(dá)嗪的[M+H]+與m/z285.0204匹配，匹配分?jǐn)?shù)為97.62，因此，初步推測(cè)兩者為甲氧芐啶和磺胺氯達(dá)嗪。

圖1 黏菌素標(biāo)準(zhǔn)品(A)和樣品的抑菌圈(B)Fig 1 the inhibition zone of (A) colistin reference substance and (B) sample

圖2 黏菌素標(biāo)準(zhǔn)品(A)和樣品的薄層色譜圖(B)Fig 2 the thin-layer chromatogram of (A) colistin reference substance and (B) sample

圖3 檢品總離子流圖(A)及響應(yīng)1質(zhì)譜提取圖(B)和響應(yīng)2質(zhì)譜提取圖(C)Fig 3 (A) Total ion chromatogram of the sample, (B) mass spectra extracted from response signal 1 and (C) mass spectra extracted from response signal 2

2.3 未知物的確證

2.3.1 UHPLC-Q/TOF MS確證 將供試品溶液，照1.2.1項(xiàng)中條件分別以m/z為285.0208和291.1452為母離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜采集(圖4～圖5)，另取磺胺氯達(dá)嗪和甲氧芐啶對(duì)照品溶液(100 ng/mL)在相同的條件下采集二級(jí)質(zhì)譜，對(duì)照品圖譜與樣品圖譜幾乎完全一致，匹配值高達(dá)98.21和97.58。添加的化合物確證為磺胺氯達(dá)嗪和甲氧芐啶。為進(jìn)一步增強(qiáng)質(zhì)譜信息的可信度，對(duì)裂解規(guī)律進(jìn)行了推導(dǎo)。

2.3.2 HPLC-DAD確證 將供試品溶液與對(duì)照品溶液色譜峰的保留時(shí)間(圖6)和光譜圖比對(duì)，并對(duì)峰純度檢查和光譜相似度進(jìn)行檢查來(lái)確證非法添加物。供試品溶液在1.2.2項(xiàng)條件下檢出2個(gè)較大的未知色譜峰，與該條件下磺胺氯達(dá)嗪和甲氧芐啶對(duì)照品溶液的保留時(shí)間一致，紫外光譜相似。供試品溶液和對(duì)照品溶液色譜峰的純度值均在998.6～999.6之間，大于純度閾值(990)，為單一物質(zhì)峰；光譜相似度檢查結(jié)果顯示：供試品溶液與對(duì)照品溶液色譜峰的光譜圖進(jìn)行匹配，匹配度均在998.5～999.5之間，高于匹配閾值(990)，可認(rèn)為是同一化合物。

2.4 未知物的含量測(cè)定 經(jīng)上述UHPLC-Q/TOF MS和HPLC-DAD雙重驗(yàn)證，確證樣品中含有磺胺氯達(dá)嗪和甲氧芐啶，照《中國(guó)獸藥典》2010版[1]一部收錄的復(fù)方磺胺氯達(dá)嗪鈉粉中的含量測(cè)定方法檢測(cè)磺胺氯達(dá)嗪鈉和甲氧芐啶，含量分別為65.4 mg/g(按磺胺氯達(dá)嗪計(jì)58.5 mg/g)和13.4 mg/g。

圖4 硫酸黏菌素可溶性粉中疑似化合物([M+H]+為m/z 285.0208)的二級(jí)質(zhì)譜圖及可能裂解規(guī)律Fig 4 MS /MS spectra of the suspected compound ([M+H]+ at m/z 285.0208) in colistin sulphate soluble powder and possible fragmentation pattern

圖5 硫酸黏菌素可溶性粉中疑似化合物([M+H]+為m/z 291.1452)的二級(jí)質(zhì)譜圖及可能裂解規(guī)律Fig 5 MS /MS spectra of the suspected compound ([M+H]+ at m/z 291.1452) in colistin sulphate soluble powder and possible fragmentation pattern

圖6 混合對(duì)照品溶液(50 μg/mL)(A)色譜圖和檢品色譜圖(B)Fig 6 Chromatogram of (A) mixed reference substances (10 μg/mL) and (B) the sample

3 討論與結(jié)論

3.1 UHPLC-Q/TOF MS色譜條件的優(yōu)化 此色譜系統(tǒng)為常規(guī)篩查非法添加藥物所用，考察流動(dòng)相組成對(duì)色譜峰的分離、靈敏度和離子化率的影響。通常選擇甲醇-水和乙腈-水作為流動(dòng)相，對(duì)一般的化合物均能滿足要求，甲醇價(jià)格較低，故選擇甲醇。流動(dòng)相中加入適量甲酸，絕大多數(shù)的正離子源的離子化效率會(huì)有一定提高。流動(dòng)相中加入適量乙酸銨，適用于部分負(fù)離子源模式下的化合物檢測(cè)。參照文獻(xiàn)[9,12-14]，將本文的條件確定為最佳條件。

3.2 UHPLC-Q/TOF MS質(zhì)譜條件的優(yōu)化 采用磺胺氯達(dá)嗪鈉和甲氧芐啶對(duì)照品溶液(100 ng/mL)，優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù)。通過(guò)一級(jí)質(zhì)譜掃描獲取目標(biāo)藥物的準(zhǔn)分子離子峰，準(zhǔn)分子離子進(jìn)入二級(jí)質(zhì)譜后發(fā)生斷裂或重排等現(xiàn)象，產(chǎn)生不同的質(zhì)核比的離子碎片，從而優(yōu)化碰撞能量和定性離子，并推導(dǎo)了可能裂解的機(jī)理。

3.3 非法添加的原因分析 該樣品薄層色譜鑒別發(fā)現(xiàn)并沒(méi)有標(biāo)示主成分的黏菌素，但采用微生物檢定法測(cè)定含量，又有非正常抑菌圈產(chǎn)生，因此，懷疑有處方外添加成分。經(jīng)UHPLC-Q/TOF MS和HPLC-DAD雙重確證，發(fā)現(xiàn)樣品中有磺胺氯達(dá)嗪和甲氧芐啶，且磺胺氯達(dá)嗪和甲氧芐啶的含量分別為58.5 mg/g和13.4 mg/g。與《中國(guó)獸藥典》2010年版一部收載的復(fù)方磺胺氯達(dá)嗪鈉粉中的規(guī)格(1000 g：磺胺氯達(dá)嗪鈉625 g與甲氧芐啶125 g)稀釋10倍接近，該樣品已經(jīng)不是簡(jiǎn)單意義上的處方外非法添加，而是有意將低濃度的復(fù)方磺胺氯達(dá)嗪鈉粉當(dāng)做硫酸黏菌素可溶性粉出售，推測(cè)生產(chǎn)企業(yè)如此做法的可能原因?yàn)閮烧咴诠π陷^為相近，而復(fù)方磺胺氯達(dá)嗪鈉粉成本較低，因此，采用這種“頂替”來(lái)謀取利潤(rùn)。

當(dāng)前獸藥行業(yè)仍不規(guī)范，處方外非法添加的現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生，且添加的成分不確定，像本文的例子甚至使用其他藥物來(lái)替代，值得引起監(jiān)管部門重視。本文從發(fā)現(xiàn)該批樣品的非法添加到建立UHPLC-Q/TOF MS篩查確證和HPLC-DAD雙重確證，發(fā)現(xiàn)非法添加的情況并對(duì)原因進(jìn)行了一定的探討，希望可以為有關(guān)部門打擊獸藥非法添加提供一定的思路。已經(jīng)發(fā)布的農(nóng)業(yè)農(nóng)村部非法添加物檢查方法，為針對(duì)某些指定藥物的非法添加，包含藥物只有50余種。由于UHPLC-Q/TOF MS的篩查范圍更廣，可建立多達(dá)幾百甚至上千種藥物的一級(jí)譜庫(kù)和二級(jí)譜庫(kù)，因此，采用UHPLC-Q/TOF MS的篩查方法，對(duì)可能存在的非法添加物進(jìn)行較全面篩查、確認(rèn)，以期為今后獸藥的風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)提供有力的技術(shù)支撐，進(jìn)而掌握獸藥質(zhì)量的真實(shí)情況。