魚腥草芩藍(lán)口服液指紋圖譜研究

陸 安，劉炳煒，杜紅娜，郭永國，郭永紅

(1.河北維爾利動(dòng)物藥業(yè)集團(tuán)有限公司，石家莊 050200； 2.河北省功能性飼料添加劑工程技術(shù)研究中心，石家莊 050200；3.石家莊市獸用功能性添加劑工程技術(shù)研究中心，石家莊 050200)

魚腥草芩藍(lán)口服液處方來源于《國家中成藥標(biāo)準(zhǔn)匯編內(nèi)科肺系(一)分冊》收載的復(fù)方魚腥草合劑[1]，該制劑用于外感風(fēng)熱引起的咽喉腫痛、急性咽炎、扁桃體炎有風(fēng)熱癥候者。家禽外感發(fā)熱是在機(jī)體本身正氣不足的條件下，復(fù)感風(fēng)、寒、燥、暑、濕、火或疫毒之氣，導(dǎo)致營衛(wèi)失和，臟腑陰陽失調(diào)，出現(xiàn)病理性體溫升高，伴有惡寒、禽冠和肉垂紅等為主要臨床表現(xiàn)的一類外感病證。該制劑的治療癥候與家禽外感發(fā)熱癥候相似，且炎癥及疼痛模型試驗(yàn)表明其具有良好的抗炎、鎮(zhèn)痛作用[2]。故將其轉(zhuǎn)化為國家三類新獸藥(證書編號(hào)：(2018)新獸藥證字5號(hào))[3]。該口服液由魚腥草、黃芩、板藍(lán)根、連翹、金銀花五味中藥組成，成分復(fù)雜，原標(biāo)準(zhǔn)中，只有魚腥草、黃芩、連翹和金銀花的薄層色譜(TLC)鑒別項(xiàng)和黃芩苷的含量測定項(xiàng)，不能全面地反映復(fù)方制劑的內(nèi)在質(zhì)量。為了更好的控制產(chǎn)品質(zhì)量，在現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，增加了指紋圖譜研究項(xiàng)，通過HPLC法建立魚腥草芩藍(lán)口服液的指紋圖譜，并對指紋圖譜中的共有色譜峰的藥材來源作了相應(yīng)歸屬，為全面控制該制劑的質(zhì)量提供了一個(gè)準(zhǔn)確可靠的方法。

1 儀器與材料

1.1 儀器 UltiMate 3000高效液相色譜儀(美國 Thermo公司)，DAD檢測器，變色龍工作站； AUW120D 型電子天平(日本 SHIMADZU 公司)；RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)；SHZ-D(III)循環(huán)水式多用真空泵(河南省予華儀器有限公司)。

1.2 試劑與對照品 綠原酸對照品(批號(hào) 110753-201415，含量96.2%)，連翹苷對照品(批號(hào) 110821-201615，含量94.9%)，精氨酸(批號(hào) 140685-201003)，均購于中國食品藥品檢定研究院；黃芩苷對照品(批號(hào) Z0271504，含量95.9%)，購于中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。乙腈為色譜純；甲醇、磷酸為分析純；水為Milli-Q 超純水。

1.3 藥材 魚腥草、金銀花、黃芩、連翹、板藍(lán)根藥材購于安國藥材市場，按《中華人民共和國獸藥典》2015版(Ⅱ部)[4]有關(guān)項(xiàng)下規(guī)定，檢驗(yàn)其性狀、顯微特征、薄層色譜、水分、灰分、含量等，均符合規(guī)定。

2 方 法

2.1 色譜條件 Thermo C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，以甲醇(A)-0.4%磷酸水溶液(B)為流動(dòng)相梯度，見表1，柱溫25 ℃，流速1.0 mL/min，檢測波長為240 nm，進(jìn)樣量10 μL。

表1 梯度洗脫程序Tab 1 Gradient elution program

2.2 樣品制備方法

2.2.1 魚腥草芩藍(lán)口服液樣品制備 取各單味藥材飲片，按配方量準(zhǔn)確稱取魚腥草1000 g，黃芩250 g，板藍(lán)根250 g，連翹100 g，金銀花100 g，加水煎煮兩次，每次加水10倍量，每次2 h，合并煎液，濾過，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，壓力保持在-0.1MPa，60 ℃水浴將濾液濃縮至相對密度為1.18～1.20(60～80 ℃)的清膏，加入乙醇至含醇量為70%，攪勻，室溫靜置24 h，濾過，濾液回收乙醇，回收方法同水煎液濃縮。濃縮至適量，加水至1000 mL，搖勻，濾過，加入0.3%苯甲酸鈉，即得。室溫保存。

2.2.2 單味藥材樣品制備 分別準(zhǔn)確稱取魚腥草1000 g、黃芩250 g、板藍(lán)根250 g、連翹100 g、金銀花飲片100 g，按2.2.1方法制備單味藥材的口服液，供HPLC分析。

2.3 溶液的制備

2.3.1 魚腥草芩藍(lán)口服液供試品溶液的制備 精密量取魚腥草芩藍(lán)口服液1 mL，置5 mL量瓶中，加入50%甲醇定容至刻度，搖勻，即得。進(jìn)樣前用孔徑為0.45 μm的微孔濾膜濾過，供HPLC檢測分析。

2.3.2 單味藥材供試品溶液的制備 精密量取各單味藥材口服液1 mL，按2.3.1方法制備各單味藥材供試品溶液。進(jìn)樣前用孔徑為0.45 μm的微孔濾膜濾過，供HPLC檢測分析。

2.3.3 對照品溶液的制備 取黃芩苷對照品、綠原酸對照品、連翹苷對照品、精氨酸對照品適量，加甲醇分別制成每1 mL含黃芩苷40.086 μg，綠原酸11.042 μg，連翹苷53.280 μg，精氨酸500.010 μg的溶液，即得。

2.4 樣品分析 分別精密量取10批魚腥草芩藍(lán)口服液供試品、各單味藥材口服液供試品及對照品各10 μL，按2.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 體外成分認(rèn)定 采用藥材樣品圖譜對比的方法，用相同的色譜條件進(jìn)行檢測，以保留時(shí)間作為鑒定標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行色譜峰的指認(rèn)，并對共有峰進(jìn)行初步歸屬分析，見圖1～5。由圖1～5可知，(1)初步建立的魚腥草芩藍(lán)口服液指紋圖譜有四個(gè)成分得到鑒定：綠原酸來源于金銀花和魚腥草；黃芩苷來源于黃芩；連翹苷來源于連翹；精氨酸來源于板藍(lán)根。(2)指紋圖譜保留時(shí)間在10～29 min共有峰主要來源于魚腥草；10～27 min共有峰主要來源于金銀花；12～34 min共有峰主要來源于黃芩；6～24 min共有峰主要來源于連翹，9～27 min共有峰主要來源于板藍(lán)根。

a.綠原酸對照品；b.魚腥草藥材；c.魚腥草芩藍(lán)口服液圖1 綠原酸對照品、魚腥草藥材、魚腥草芩藍(lán)口服HPLC色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms of Chlorogenic acid、Houttuynia cordata Thunb、Yuxingcaoqinlan oral liquid

a.綠原酸對照品；d.金銀花藥材；c.魚腥草芩藍(lán)口服液圖2 綠原酸對照品、金銀花藥材、魚腥草芩藍(lán)口服HPLC色譜圖Fig 2 HPLC chromatograms of Chlorogenic acid、Lonicerae Japonicae Flos、Yuxingcaoqinlan oral liquid

e.黃芩苷對照品；f.黃芩藥材；c.魚腥草芩藍(lán)口服液圖3 黃芩苷對照品、黃芩藥材、魚腥草芩藍(lán)口服HPLC色譜圖Fig 3 HPLC chromatograms of Baicalin、Scutellaria、Yuxingcaoqinlan oral liquid

g.連翹苷對照品；h.連翹藥材；c.魚腥草芩藍(lán)口服液圖4 連翹苷對照品、連翹藥材、魚腥草芩藍(lán)口服HPLC色譜圖Fig 4 HPLC chromatograms of Phillyrin、Fororsythia、Yuxingcaoqinlan oral liquid

i.精氨酸對照品；j.板藍(lán)根藥材；c.魚腥草芩藍(lán)口服液圖5 精氨酸對照品、板藍(lán)根藥材、魚腥草芩藍(lán)口服HPLC色譜圖Fig 5 HPLC chromatograms of Arginine、Isatidis Radix、Yuxingcaoqinlan oral liquid

3.2 指紋圖譜的建立與分析 根據(jù)以上樣品分析結(jié)果及建立的10批魚腥草芩藍(lán)口服液樣品的色譜圖，見圖6，魚腥草芩藍(lán)口服液標(biāo)示出22個(gè)共有峰，在相同色譜條件下，以保留時(shí)間作為鑒定標(biāo)準(zhǔn)，參照文獻(xiàn)[5-6]中各生藥譜峰相關(guān)性的研究方法，單味藥材及復(fù)方色譜圖對比，進(jìn)行色譜峰的指認(rèn)，并對該22個(gè)共有峰進(jìn)行了相應(yīng)的藥材來源歸屬：峰4、9、17、18、19、20、21、22歸屬于黃芩，峰2、4、5、6、7、10、11、12、14歸屬于金銀花，峰13歸屬于板藍(lán)根，峰2、4、5、6、14歸屬于魚腥草，峰1、3、6、8、9、10、15歸屬于連翹。經(jīng)與對照品圖譜(圖7)對比，峰4為綠原酸、峰13為精氨酸，峰15為連翹苷，峰16為黃芩苷。

采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)軟件(2012版)對10批魚腥草芩藍(lán)口服液樣品HPLC圖譜進(jìn)行處理，匹配結(jié)果見圖8，以16號(hào)峰黃芩苷作為參照確定22個(gè)共有峰中的10個(gè)共有峰為構(gòu)成魚腥草芩藍(lán)口服液指紋圖譜的特征峰，其保留時(shí)間和峰面積為1，各特征峰的相對保留時(shí)間及相對峰面積分別列于表2和表3，10批魚腥草芩藍(lán)口服液樣品與對照指紋圖譜相似度分別為0.989、0.992、0.981、0.954、0.998、0.998、1.000、0.997、0.997、0.994。

圖6 10批魚腥草芩藍(lán)口服液HPLC指紋圖譜共有模式Fig 6 Common pattern of HPLC fingerprint of 10 batches of Yuxingcaoqinlan oral liquid

a.綠原酸；e.黃芩苷；g.連翹苷；i.精氨酸圖7 對照品HPLC圖譜Fig 7 HPLC chromatograms of reference substance

圖8 10批魚腥草芩藍(lán)口服液HPLC指紋圖譜縱向疊加圖Fig 8 Vertical overlap of HPLC fingerprint of 10 batches of Yuxingcaoqinlan oral liquid

樣品編號(hào)峰號(hào)124569131516S20S10.2170.3830.5160.5480.5750.7840.8530.9301.0001.114S20.2180.3820.5140.5470.5760.7810.8500.9371.0001.116S30.2160.3830.5160.5480.5780.7800.8510.9391.0001.109S40.2190.3800.5180.5490.5790.7890.8510.9271.0001.111S50.2150.3810.5160.5460.5770.7880.8520.9331.0001.108S60.2200.3840.5190.5480.5740.7850.8550.9351.0001.121S70.2190.3850.5200.5470.5740.7860.8560.9361.0001.129S80.2180.3850.5150.5460.5780.7870.8550.9371.0001.115S90.2170.3810.5160.5430.5790.7890.8570.9311.0001.125S100.2190.3820.5190.5440.5760.7840.8520.9381.0001.107平均0.2180.3830.5170.5470.5770.7850.8530.9341.0001.116

表3 10批樣品共有指紋峰的峰面積比值Tab 3 Relative peak area of characteristic absorption peaks for the 10 batches of samples

3.3 方法學(xué)考察

3.3.1 精密度試驗(yàn) 取同一批魚腥草芩藍(lán)口服液樣品，按樣品溶液制備方法制備供試品溶液，以黃芩苷的峰面積為考察指標(biāo)，連續(xù)進(jìn)樣6次，RSD值為0.59%(n=6)，表明儀器精密度良好。

3.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批魚腥草芩藍(lán)口服液樣品，按樣品溶液制備方法制備供試品溶液，以黃芩苷的峰面積為考察指標(biāo)，分別在0、6、12、18、24 h測定HPLC色譜圖，RSD值為0.83%(n=6)，表明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批魚腥草芩藍(lán)口服液樣品，按樣品溶液制備方法平行操作制備6份供試品溶液，以黃芩苷的峰面積為考察指標(biāo)，RSD值為1.05%(n=6)，表明方法重復(fù)性良好。

4 討論與結(jié)論

4.1 色譜條件的選擇與確定 研究過程中對樣品的溶劑及色譜條件中流動(dòng)相、檢測波長、柱溫、流速進(jìn)行了嚴(yán)格的選擇性考察。

研究表明，50%甲醇溶解的樣品出峰數(shù)量多，基線平穩(wěn)，且峰形較好，因此選用50%甲醇作為供試品溶液所用溶劑。對魚腥草芩藍(lán)口服液樣品進(jìn)行了紫外(200 nm～400 nm)全波長掃描，結(jié)果表明，在240 nm下出峰最豐富，峰形最好，其他波長下未見新成分色譜峰，因此選定240 nm為指紋圖譜測定波長。同一條件下考察柱溫對各峰的影響，結(jié)果相似，考慮到對色譜柱壽命的影響[7-8]，最后選定25 ℃作為最佳條件。流動(dòng)相條件優(yōu)化時(shí)分別比較了甲醇-0.4%磷酸水溶液、乙腈-0.4%磷酸水溶液作為流動(dòng)相的分離效果，結(jié)果表明同一條件下甲醇較乙腈對魚腥草芩藍(lán)口服液的分離效果好，出峰較多，峰形較好。因此，選擇甲醇-0.4%磷酸水溶液作為流動(dòng)相。比較甲醇-0.4%磷酸水溶液系統(tǒng)5種不同梯度變化程序，結(jié)果表明，按表1梯度程序洗脫，在240 nm波長下色譜峰分離情況較好?？疾炝松鲜鲞x定條件下60 min色譜圖，發(fā)現(xiàn)50 min后無特征峰出現(xiàn)，故將分析時(shí)間定為50 min。

4.2 參照峰的選擇與確定 指紋圖譜中選擇的10個(gè)特征峰在色譜圖共有峰中均屬相對含量較大、分離度較好的色譜峰。不僅包括了該制劑大部分原料藥的主要成分，還包括了該制劑現(xiàn)有質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中用于質(zhì)量控制的可控成分黃芩苷、綠原酸、連翹苷和精氨酸，現(xiàn)代藥理研究表明，黃芩中的黃酮類成分是其發(fā)揮藥理活性的基礎(chǔ)[9-10]，其中黃芩苷是最主要的活性成分之一，亦具有較好的抗菌、抗病毒、抗炎及抑制免疫作用[11-12]；金銀花和魚腥草中的綠原酸、連翹中的連翹苷也具有良好的抗菌、抗病毒等作用[13-15]，板藍(lán)根中的精氨酸能夠參與機(jī)體一系列免疫過程[16-18]，其中黃芩苷出峰時(shí)間適中且有法定對照品，故選取其作為魚腥草芩藍(lán)口服液指紋圖譜的參照峰。

4.3 色譜指紋圖譜的建立和辨認(rèn) 通過多批次魚腥草芩藍(lán)口服液樣品指紋圖譜分析，建立了不同批次魚腥草芩藍(lán)口服液的指紋圖譜，并通過單味藥材及復(fù)方色譜圖對比，進(jìn)行色譜峰的指認(rèn)，對22個(gè)共有峰進(jìn)行了相應(yīng)的藥材來源歸屬。魚腥草芩藍(lán)口服液具有較穩(wěn)定的特征指紋圖譜，大部分峰形尖銳，分離度好。22個(gè)共有峰中源自板藍(lán)根的色譜峰較少，僅有1個(gè)；其余四味藥材相對均勻分布，源自魚腥草、黃芩、連翹、金銀花的色譜峰個(gè)數(shù)分別為5、8、7、9，且源自黃芩的相對峰面積明顯大于其他峰面積。

以黃芩苷為參照峰確定了魚腥草芩藍(lán)口服液的10個(gè)特征峰，并通過相似度評價(jià)系統(tǒng)軟件得到10批魚腥草芩藍(lán)口服液的對照指紋圖譜及各批樣品與對照指紋圖譜之間的相似度。結(jié)果10批樣品相似度分別為0.989、0.992、0.981、0.954、0.998、0.998、1.000、0.997、0.997、0.994，均在0.9以上。

試驗(yàn)結(jié)果表明，魚腥草芩藍(lán)口服液體外所含化學(xué)成分可以通過指紋圖譜表達(dá)，為全面控制該制劑質(zhì)量奠定了基礎(chǔ)。

4.4 結(jié)論 復(fù)方中藥口服液成分復(fù)雜，僅測定某種單一的成分并不能全面的反映制劑的質(zhì)量，利用HPLC指紋圖譜技術(shù)，可以最大程度地顯示復(fù)方的內(nèi)在特性，實(shí)現(xiàn)全面控制產(chǎn)品質(zhì)量的目的。

經(jīng)過反復(fù)試驗(yàn)研究，對魚腥草芩藍(lán)口服液指紋圖譜的分析條件進(jìn)行逐級(jí)優(yōu)化，確定樣品的處理方法，并建立了不同批次魚腥草芩藍(lán)口服液的指紋圖譜，且經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證證明指紋圖譜方法可行。

魚腥草芩藍(lán)口服液指紋圖譜的建立，可依據(jù)多個(gè)信息質(zhì)量參數(shù)進(jìn)行全方位的質(zhì)量變動(dòng)監(jiān)控，直觀而全面的揭示魚腥草芩藍(lán)口服液的質(zhì)量變化特征，為魚腥草芩藍(lán)口服液的質(zhì)量控制提供了重要的方法。