子宮內(nèi)膜癌分子分型與PD-1/PD-L1阻斷治療*

高境澤 吳 霞

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟醫(yī)院婦產(chǎn)科，上海 200127)

子宮內(nèi)膜癌(Endometrial cancer，EC)是常見的女性生殖道惡性腫瘤，無論是我國還是歐美國家EC的發(fā)病率逐年增高[1,2]。EC的治療方法主要包括手術(shù)、放療、化療和內(nèi)分泌治療。對于病灶局限于子宮的早期EC患者，手術(shù)即可達到較好的治療效果；但當(dāng)患者已存在轉(zhuǎn)移病灶或疾病復(fù)發(fā)時，傳統(tǒng)治療方法療效有限，患者預(yù)后通常較差[2]。對于轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)的EC患者，探詢新的治療方法如免疫治療或靶向治療已屬當(dāng)務(wù)之急。近年來隨著分子生物學(xué)技術(shù)的進展，對EC的認(rèn)識從傳統(tǒng)病理分型進一步深入到分子分型，其中分子分型為POLE (DNA polymerase ε，POLE)突變型和微衛(wèi)星不穩(wěn)定(Microsatellite instability，MSI)高突變型EC患者可能是程序性死亡蛋白1(Programmed death protein-1，PD-1)/程序性死亡蛋白配體1 (Programmed death protein-ligand1，PD-L1)阻斷治療的獲益人群，利用分子分型指導(dǎo)患者個體化免疫治療有望成為EC治療的重要臨床策略。本文就EC傳統(tǒng)病理分型、分子分型及PD-1/PD-L1阻斷治療在EC中的研究進展作一綜述。

1 EC傳統(tǒng)病理分型

1.1EC傳統(tǒng)病理分型 基于EC發(fā)展過程中的雌孕激素作用、預(yù)后因素以及流行病學(xué)因素，1983年Bockman[3]提出了EC的傳統(tǒng)病理分型方法，即將EC分為Ⅰ型(雌激素依賴型)和Ⅱ型(非雌激素依賴型)。Ⅰ型EC為子宮內(nèi)膜樣腺癌(Endometrioid endometrial cancers，EEC)，約占所有EC患者的80%。絕大多數(shù)EEC是低級別腫瘤(組織病理學(xué)分級為1級或2級)，其形成機制為“二步機制”，即由不典型子宮內(nèi)膜增生或子宮內(nèi)膜樣上皮內(nèi)瘤變發(fā)展為雌激素引發(fā)的“腺瘤癌”。EEC患者常伴有肥胖、高血壓、糖尿病、腫瘤細(xì)胞雌孕激素受體陽性率高，預(yù)后良好。EEC中常見的基因突變有PTEN失活和K-Ras、β-catenin突變。Ⅱ型EC為非雌激素依賴性，主要包括漿液性癌(Serous carcinoma,SC)、透明細(xì)胞癌(Clear cell carcinoma,CCC)和癌肉瘤等，Ⅱ型EC侵襲性強，患者預(yù)后不良。Ⅱ型EC中常見的基因突變有Tp53、PIK3CA和PPP2RIA等[3]。

1.2EC傳統(tǒng)病理分型的局限 如前所述，EC的傳統(tǒng)病理分型可以部分反映腫瘤的特征，在臨床工作中區(qū)分Ⅰ型和Ⅱ型EC對于選擇治療方案亦具重要指導(dǎo)意義。然而，傳統(tǒng)病理分型的局限性也日趨明顯。首先從形態(tài)組織學(xué)角度，由于一些EC腫瘤本身的變異性和病理學(xué)家專業(yè)知識不同，這些腫瘤的診斷可能含混不清，很難被精確歸類于Ⅰ型或Ⅱ型[4]；其次從分子水平而言，盡管一些突變可能更常出現(xiàn)于Ⅰ型或Ⅱ型EC，但Ⅰ型和Ⅱ型EC的基因突變存在重疊，并且沒有任何一個基因突變被發(fā)現(xiàn)僅特異性存在于Ⅰ型或Ⅱ型EC[5,6]；最后，EC的突變譜非常復(fù)雜，每一型EC本身就存在基因異質(zhì)性。因此，為了更精準(zhǔn)地為EC患者評估預(yù)后和制定個體化治療方案，借助全基因組測序和轉(zhuǎn)錄分析技術(shù)探索EC的分子分型特征具有重要意義。

2 EC分子分型

近年來，隨著基因測序技術(shù)的不斷發(fā)展基于基因特征的腫瘤分類應(yīng)運而生。1999年美國國立癌癥研究所(NCI)提出了腫瘤分子分型的概念，即以高通量深度測序技術(shù)為基礎(chǔ)，按照分子特征對腫瘤進行分類。2013年，美國癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas，TCGA )對373例EC樣本(包括307例EEC，53例SC，13例混合性)進行了基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白組學(xué)的研究，提出將EC區(qū)分為POLE突變型(7%)，MSI高突變型(28%)，拷貝數(shù)低型(39%)和拷貝數(shù)高型/漿液性(26%)這四種分子亞型[7]。由于高通量深度測序經(jīng)濟成本高、耗時長，為降低EC分子分型的成本，Talhouk等使用p53免疫組化分析替代高拷貝數(shù)狀態(tài)測定，結(jié)合POLE突變狀態(tài)和錯配修復(fù)(Mismatch repair，MMR)蛋白的免疫組化測試(MLH1，MSH2，MSH6和PMS2)對石蠟包埋標(biāo)本進行聯(lián)合分析，將全系列143例EC標(biāo)本分成MSI-high型(41例，29%)，POLE突變型(12例，8%)，p53野生型(63例，44%)和p53突變型(25例，17.5%)[8]。作者提出，這種簡單易行的方法可以在臨床大規(guī)模使用以指導(dǎo)EC分子分型、危險分級和治療。

2.1POLE突變型EC DNA聚合酶ε (DNA polymerase epsilon，polε)是在真核生物中發(fā)現(xiàn)的DNA聚合酶,與polα、polδ同屬DNA聚合酶家族，并由POLE1、POLE2、POLE3和POLE4四個亞基組成[9]。POLE作為DNA聚合酶ε的核心催化亞基，具有DNA鏈延長和延長中校正復(fù)制錯誤這兩種催化活性。聚合酶的校正過程，主要通過POLE的3′→5′核酸外切酶區(qū)域，對復(fù)制錯誤單鏈DNA進行識別和剪切[10]。正常情況下，平均一個堿基對在完成一次分裂時發(fā)生突變率約為10-10。如果POLE的核酸外切酶區(qū)域發(fā)生突變則會導(dǎo)致其無法完成校正工作，DNA復(fù)制過程中發(fā)生的堿基突變率將升高10～100倍,并導(dǎo)致大量突變的基因在細(xì)胞中累積。

POLE突變型的腫瘤包括EC、結(jié)直腸癌、高級別膠質(zhì)瘤和卵巢癌，其中EC是迄今已知POLE基因出現(xiàn)突變比例最高的惡性腫瘤[10]。約5%～10%的EC在POLE的核酸外切酶區(qū)域中攜帶體細(xì)胞突變，即為POLE突變型EC。POLE突變型EC大多是EEC，特別是組織病理分級為3級的EEC (EEC3)，其特征性的突變譜包括PTEN (94%)、 PIK3CA (71%)、 PIK3R1 (65%)、FBXW7 (82%)、ARID1A (76%)、KRAS (53%)和ARID5B (47%)。較之其他類型EC，POLE突變型EC具有極高的突變負(fù)荷 (232×106mutations/Mb)[7]。

與其他三種分子分型的EC患者相比，POLE突變型患者可能會有更好的預(yù)后[11-13]。POLE突變型EC患者預(yù)后較好的確切機制尚不完全清楚，可能的原因有以下兩點：①POLE突變型EC可能對標(biāo)準(zhǔn)的抗癌治療如化療或放療更敏感[14,15]；②由于POLE突變型EC具有非常高的突變負(fù)荷，巨大數(shù)量的體細(xì)胞突變產(chǎn)生大量的腫瘤新生抗原，故POLE突變型EC可能為強免疫原性腫瘤，利于誘發(fā)機體的抗腫瘤免疫應(yīng)答[16-18]。

2.2MSI高突變型EC 微衛(wèi)星又稱“短串聯(lián)重復(fù)序列”，是遍布人類基因的編碼和非編碼區(qū)域基因中一段核苷酸重復(fù)序列，重復(fù)的單位長度為1～6個堿基[19]。隨著DNA復(fù)制的進行，DNAMMR系統(tǒng)可識別和修復(fù)在DNA復(fù)制和重組過程中可能出現(xiàn)堿基的錯誤插入、缺失和部分類型的DNA損傷，故MMR對于監(jiān)督DNA高保真復(fù)制具有重要意義[20]。當(dāng)MMR系統(tǒng)缺陷時，即出現(xiàn)MSI。MSI現(xiàn)象存在于多種類型的實體瘤中如EC、結(jié)直腸癌、胃癌、卵巢癌、肝膽管癌、尿路癌、腦癌和皮膚癌[21]。在腫瘤樣本中，MSI表型可以通過PCR檢測確定。1997年美國國立癌癥研究所推薦將NR21、2NR24、NR27、BAT25和BAT26這5個微衛(wèi)星位點作為MSI診斷的標(biāo)準(zhǔn)，通過對這5個位點進行PCR檢測，可以將腫瘤分為3型：如果有2個或2個以上微衛(wèi)星位點出現(xiàn)不穩(wěn)定，稱為微衛(wèi)星高度不穩(wěn)定型(MSI-high，MSI-H)；如果1個微衛(wèi)星位點出現(xiàn)不穩(wěn)定，稱為微衛(wèi)星低度不穩(wěn)定型(MSI-low，MSI-L)；如果5個位點均未檢測到不穩(wěn)定，則稱為微衛(wèi)星穩(wěn)定型(MSI-stable,MSS)[22]。

在所有EC病例中，MSI高突變型EC占比大約30%，其通常為EEC，且腫瘤細(xì)胞的組織病理學(xué)分級通常為高級別。MSI-H型EC具有較高的突變負(fù)荷 (18×106mutations/Mb)，其特征性的突變譜包括PTEN (88%)、RPL22 (33%)、KRAS (35%)、PIK3CA (54%)、PIK3R1 (40%)和RID 1A (37%)[23]。McMeekin等通過統(tǒng)計1 024例EEC的臨床數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)MMR缺陷型EEC與一些不良預(yù)后因素如FIGO分期晚、腫瘤細(xì)胞高級別和淋巴脈管間隙受累及相關(guān)，但其預(yù)后與MMR完善型EEC無顯著差異，這提示MMR缺陷抵消了這些不良預(yù)后因素的影響，即MMR缺陷EEC可能誘發(fā)了較強的抗腫瘤免疫應(yīng)答[24]。

2.3低拷貝數(shù)型與高拷貝數(shù)型EC 拷貝數(shù)變異(Copy-number variant，CNV)被定義為基因組部分重復(fù)的現(xiàn)象[7]。具體來說，它是一定數(shù)量堿基對的一種復(fù)制或刪除事件。在哺乳動物中，拷貝數(shù)變異在產(chǎn)生群體變異以及疾病表型方面起重要作用?；赥CGA的數(shù)據(jù)，低拷貝數(shù)型EC包括60.0%的低級別EEC，8.7%的EEC3，2.3%的SC和25%的混合型癌。低拷貝數(shù)型EC的突變負(fù)荷低(2.9×106mutations/Mb),常見的突變?yōu)?PTEN (77%)、CTNNB1 (52%)、PIK3CA (53%)、PIK3R1 (33%)和ARID1A (42%)。高拷貝數(shù)型EC涵蓋5.0%的低級別EEC，19.6%的EEC3，97.7%的SC和75%的混合型癌，其預(yù)后是四種分型中最差的。高拷貝數(shù)型EC的突變負(fù)荷低(2.3×106mutations/Mb)，常見的突變?yōu)門P53 (92%)、PPP2R1A (22%) 和 PIK3CA (47%)。

3 EC分子分型與PD-1/PD-L1阻斷治療

3.1PD-1/PD-L1阻斷治療 近年來腫瘤免疫治療突飛猛進。2012年《新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志》報道了抗PD-1、PD-L1抗體在晚期腫瘤患者中獲得了持久的腫瘤消退及疾病穩(wěn)定期，這兩個里程碑式的臨床試驗使腫瘤免疫治療進入了一個新時代[25,26]。美國《科學(xué)》雜志將癌癥免疫治療列為2013年最重大的科學(xué)突破之一，這預(yù)示著免疫治療在惡性腫瘤治療領(lǐng)域的廣闊前景。迄今多個臨床試驗已經(jīng)證實了抗PD-1/PD-L1藥物在晚期黑素瘤、非小細(xì)胞肺癌、膀胱癌、腎細(xì)胞癌及霍奇金淋巴瘤等惡性腫瘤中的客觀臨床作用[27,28]。2017年6月，ASCO會議報道了PD-1單抗pembrolizumab聯(lián)合E7080(樂伐替尼，多靶點抗血管生成藥物)治療EC的臨床數(shù)據(jù)(注冊號NCT02501096)。該試驗中已納入23例晚期EC患者(至少接受過一次系統(tǒng)治療)，接受治療后有11人(47.8%)達到部分緩解，另有11人(47.8%)為疾病穩(wěn)定，研究結(jié)果顯示了抗PD-1/PD-L1藥物在EC治療中的巨大潛力[29]。

3.2PD-1/PD-L1阻斷治療的療效預(yù)測指標(biāo)-TMB PD-1/PD-L1阻斷治療在大多數(shù)腫瘤中的有效率為40%左右，因此精準(zhǔn)篩選能從該治療中獲益的患者、剔除不能獲益的患者以避免治療相關(guān)不良反應(yīng)成為腫瘤學(xué)家的共識。腫瘤突變負(fù)荷(Tumor mutation burden，TMB)被認(rèn)為可能是篩選PD-1/PD-L1阻斷治療獲益患者的生物標(biāo)志物之一。TMB代表在腫瘤樣本中基因外顯子編碼區(qū)每兆堿基發(fā)生突變的數(shù)目，是評估腫瘤免疫原性的重要指標(biāo)之一。理論上，這些突變的基因進行轉(zhuǎn)錄表達新的抗原，每兆堿基中累積的突變數(shù)目越多，其顯示的抗原性就越強，腫瘤微環(huán)境中，免疫T細(xì)胞可識別殺傷的腫瘤細(xì)胞就越多。對一項使用nivolumab治療非小細(xì)胞肺癌的Ⅲ期臨床試驗結(jié)果進行回顧性分析，依據(jù)TMB將患者分為三組，0～99個突變?yōu)榈蚑MB組，100～242個突變?yōu)橹蠺MB組，243個或以上突變?yōu)楦逿MB組。高TMB組nivolumab治療效果明顯優(yōu)于化療效果，患者對nivolumab和化療藥物的反應(yīng)率分別為 47% 和 28%，疾病無進展生存時間分別為9.7個月和 5.8個月[30]。研究者認(rèn)為：與腫瘤組織PD-L1表達水平相比，TMB作為生物標(biāo)志物能更好地篩選出獲益人群。Rizvi等人的研究同樣顯示在非小細(xì)胞肺癌患者中，pembrolizumab 臨床療效與TMB密切相關(guān)[31]。在高突變負(fù)荷(超過中位突變負(fù)荷)的非小細(xì)胞肺癌患者中，高達73%的患者可出現(xiàn)持久的臨床獲益(部分緩解或疾病穩(wěn)定持續(xù)時間> 6個月)，而低突變負(fù)荷患者的持久臨床獲益率僅有13%，兩組患者對pembrolizumab的客觀反應(yīng)率分別為63%和0，中位疾病無進展生存時間分別為14.5個月和3.7個月。

3.3POLE型EC與PD-1/PD-L1阻斷治療 如前所述，在EC的四種分子分型中，POLE型、MSI高突變型EC的腫瘤突變負(fù)荷較高，分別為232×106/Mb和18×106/Mb，遠超其他組(2.6×106～2.9×106/Mb)，因此POLE型和MSI高突變型EC患者最有望從PD-1/PD-L1阻斷治療中受益[7]。Bellone等[32]檢測了131例EC患者腫瘤組織的POLE突變情況，11例 (8.5%)患者為POLE突變型，與POLE野生型EC相比，POLE突變型EC腫瘤組織中浸潤的CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)量顯著增加，且浸潤T淋巴細(xì)胞表面PD-1表達顯著升高，患者的疾病無進展生存時間亦顯著延長。Mehnert等[33]對TCGA樣本庫中的EC標(biāo)本進行了HE染色，POLE突變型EC腫瘤組織中淋巴細(xì)胞浸潤最豐富，MSI突變型EC淋巴細(xì)胞浸潤程度高于MSS型EC，但低于POLE突變型EC。上述研究結(jié)果提示POLE突變型EC腫瘤組織局部微環(huán)境中存在較活躍的免疫應(yīng)答反應(yīng)，如能在此基礎(chǔ)上進一步給予PD-1/PD-L1阻斷治療則有望誘發(fā)更有效的抗腫瘤免疫反應(yīng)。

雖然迄今尚無PD-1/PD-L1阻斷治療用于POLE突變型EC的大規(guī)模臨床試驗報道，但近期的幾個案例報道都顯示了PD-1單抗治療POLE突變型EC療效顯著[34,35]。一名57歲的混合性透明細(xì)胞/內(nèi)膜樣EC患者經(jīng)歷手術(shù)、化療及抗血管生成治療后疾病依然進展。腫瘤組織全外顯子測序發(fā)現(xiàn)該患者為POLE突變型EC，且具有極高突變負(fù)荷 (TMB=117.3/Mb，總突變數(shù)=4 660)。在開始接受nivolumab治療的6周后，患者臨床情況顯著改善并恢復(fù)正?；顒樱趎ivolumab治療的第3、5及7個月所行CT掃描均顯示腹部、盆腔內(nèi)和腹膜后的轉(zhuǎn)移灶顯著消退[35]。另一例53歲EC(組織病理學(xué)3級)患者初次手術(shù)治療后很快復(fù)發(fā)，患者接受化療及外照射，2年后鎖骨上淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、后腹膜和盆腔淋巴結(jié)腫大致雙下肢極度水腫，患者參加了一項pembrolizumab的Ⅰ期臨床試驗，用藥后臨床狀況很快改善，雙下肢水腫明顯緩解。Pembrolizumab用藥后的8周療效評價為部分緩解，用藥后14個月依然為緩解。對患者復(fù)發(fā)的腫瘤組織行基于雜交捕獲的全基因組測序顯示，POLE核酸外切酶區(qū)域存在突變，符合POLE突變型EC。

3.4MSI高突變型 EC與PD-1/PD-L1阻斷治療 2015年，Le等[36]的研究顯示PD-1單抗pembrolizumab對于MMR缺陷腫瘤的療效顯著高于MMR完善的腫瘤。該研究表示，抗PD-1/PD-L1治療MMR缺陷EC有效率較高的內(nèi)在原因可能是MMR缺陷EC的強免疫原性。腫瘤組織的全外顯子測序顯示MMR缺陷腫瘤中平均有1 782個體細(xì)胞突變，其中預(yù)計有578個能產(chǎn)生新抗原；而MMR完善的腫瘤中僅有73個體細(xì)胞突變，預(yù)計能產(chǎn)生新抗原的僅21個[36]。2017年，Le等[37]進一步對86例(包括12種腫瘤類型)晚期MMR缺陷的腫瘤患者進行PD-1單抗pembrolizumab治療，結(jié)果顯示57%的患者出現(xiàn)客觀影像學(xué)反應(yīng)，21%的患者獲得完全緩解。對治療有應(yīng)答的患者進行功能分析，發(fā)現(xiàn)與腫瘤突變抗原產(chǎn)生應(yīng)答的新生抗原特異性T細(xì)胞克隆在體內(nèi)快速擴增，提示存在大量突變抗原的MMR缺陷腫瘤對PD-1/PD-L1阻斷治療更敏感。在該項研究中包含了15例MMR缺陷的EC患者，這15例EC患者行pembrolizumab治療的客觀有效率為53%，疾病控制率則高達73%。

2017年5月，默沙東公司宣布美國FDA加速批準(zhǔn)了PD-1抗體pembrolizumab對于MSI-H型或MMR缺陷性腫瘤的治療。該批準(zhǔn)適應(yīng)證首次基于腫瘤分子分型特征而不是組織來源，這意味著分子分型在腫瘤精準(zhǔn)治療方面的重要地位，根據(jù)分子分型特征實行異病同治的時代已經(jīng)開啟。

4 展望

EC是常見的女性生殖道惡性腫瘤，目前對EC的認(rèn)識從傳統(tǒng)病理分型進一步深入到分子分型，其中分子分型為POLE突變型、MSI高突變型EC因攜帶大量突變基因故為強免疫原性腫瘤。對EC患者進行分子分型一方面有助于預(yù)后判斷，更為重要的是利用分子分型指導(dǎo)患者個體化免疫治療，以POLE突變和MSI-H為生物標(biāo)記物有助于精準(zhǔn)篩選能從抗PD-1/PD-L1阻斷治療中獲益的EC患者、剔除不能獲益的患者而免于治療相關(guān)不良反應(yīng)的傷害。此外，針對POLE突變型、MSI高突變型EC患者，將PD-1/PD-L1阻斷治療聯(lián)合抗血管生成藥物或傳統(tǒng)放、化療有望取得更好的臨床療效。期待盡早開展PD-1/PD-L1阻斷治療用于POLE突變型、MSI高突變型EC患者的多中心、大樣本臨床試驗，使得免疫檢查點阻斷治療能取得更多新進展，造福更多的EC患者。

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