小檗堿、巴馬汀和藥根堿在“三明治”培養(yǎng)大鼠原代肝細(xì)胞中的膽汁外排特征

梁瑞峰，宋獻(xiàn)美，葛文靜，張 峰，代 震，李 寧，田 萍，李更生

(1. 河南省中醫(yī)藥研究院中藥研究所，河南 鄭州 450004；2. 河南醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校微生物與免疫學(xué)教研室，河南 鄭州 451191)

經(jīng)腸道吸收的藥物由腸系膜靜脈匯總至肝門靜脈后，經(jīng)肝細(xì)胞的血竇側(cè)膜進(jìn)入肝細(xì)胞內(nèi)，在肝細(xì)胞內(nèi)的I相和II相代謝酶作用下，經(jīng)氧化、還原、水解、結(jié)合等代謝反應(yīng)后，其最終產(chǎn)物經(jīng)肝細(xì)胞的膽管側(cè)膜排進(jìn)膽汁，進(jìn)入腸道。在這一過程中，除被動擴(kuò)散外，肝細(xì)胞血竇側(cè)的攝取轉(zhuǎn)運(yùn)體可將藥物攝取轉(zhuǎn)運(yùn)至肝細(xì)胞內(nèi)，膽管側(cè)的外排轉(zhuǎn)運(yùn)體可將底物排進(jìn)膽汁[1-2]。肝臟轉(zhuǎn)運(yùn)體直接關(guān)系著藥物的分布、代謝、肝臟清除等體內(nèi)過程，不僅能影響藥效，而且有可能誘發(fā)藥物的不良反應(yīng)。因此，了解藥物的肝臟轉(zhuǎn)運(yùn)特征對于研究藥物的體內(nèi)過程和不良反應(yīng)具有重要的意義。

小檗堿、巴馬汀和藥根堿是中藥黃連的主要成分，具有相似的理化性質(zhì)及化學(xué)結(jié)構(gòu)。本課題組前期研究表明，小檗堿、巴馬汀和藥根堿進(jìn)入肝細(xì)胞均以主動轉(zhuǎn)運(yùn)為主，Oatp1a1、Oatp1a4、Oatp1b2、Oct1可能介導(dǎo)了小檗堿和巴馬汀的肝臟攝取，Oatp1b2和Oct1參與了藥根堿的主動轉(zhuǎn)運(yùn)[3]。然而，小檗堿、巴馬汀和藥根堿的膽汁外排特征尚不明確。本研究通過“三明治”培養(yǎng)大鼠原代肝細(xì)胞(sandwich cultured rat hepatocytes, SCRH)模型，評價(jià)小檗堿、巴馬汀、藥根堿在大鼠肝細(xì)胞中的外排轉(zhuǎn)運(yùn)特征，為研究相關(guān)藥物的體內(nèi)過程提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1動物SPF級SD大鼠，♂，體質(zhì)量(200±20)g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK(京)2012-0001。

1.2藥品與試劑鹽酸小檗堿(批號110713-201613)、鹽酸藥根堿(批號110733-201609)、鹽酸巴馬汀(批號110732-201611)、鹽酸維拉帕米(verapamil，Ver，批號100223-200102)、丙磺舒(probenecid，PBC，批號101113-201101)、環(huán)孢素A(ciclosporinA，CsA，批號130495-201303)，均購自中國食品藥品檢定研究院；DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清購自Hyclone公司；兔抗P-gp、Mrp2多克隆抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；羊抗兔IgG 抗體、GAPDH抗體購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；對乙酰氨基酚、鼠尾膠原、MK571購自Sigma公司；Matrigel基質(zhì)膠購自BD公司；乙腈為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

1.3儀器Xevo TQS型三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，配有Waters Acquity 型超高效液相色譜儀(美國Waters公司)；2K15型高速離心機(jī)(德國Sigma公司)；Synergy NEO型全功能酶標(biāo)儀(Bio-Tek公司)；XSJ-D型倒置相差顯微鏡(重慶光學(xué)儀器廠)；3164型細(xì)胞培養(yǎng)箱(Forma Scientific公司)。

1.4SCRH模型的建立參照文獻(xiàn)采用兩步灌流法分離大鼠原代肝細(xì)胞[4]：大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(100 mg·kg-1)麻醉，注射肝素(250 IU·kg-1)以抗凝，75%乙醇浸泡消毒，無菌條件下打開腹腔，門靜脈插管，以D-Hanks液灌流，灌注10 s后，結(jié)扎下腔靜脈通往腎靜脈遠(yuǎn)端，在下腔靜脈腹腔段插管同時(shí)結(jié)扎胸腔段靜脈。繼續(xù)灌注至肝臟變?yōu)橥咙S色，灌注37℃ 0.05% Ⅳ型膠原酶液300 mL，流速20 mL·min-1，然后分離軟化的肝臟，撕開肝臟包膜，將肝細(xì)胞收集到4℃ DMEM培養(yǎng)液中，100目細(xì)胞篩過濾，細(xì)胞懸液低速離心(4℃，600 r·min-1，1 min)3次，按細(xì)胞數(shù)4×108·L-1鋪于經(jīng)過鼠尾膠原處理過的24孔板，每孔體積0.5 mL；用含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)液在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)4 h，貼壁后改換含有0.25 g·L-1Matrigel膠的無血清完全培養(yǎng)液培養(yǎng)形成“三明治”構(gòu)型，每24 h換液1次，直至d 4膽管形成[5]。

1.5SCRH模型P-gp和Mrp2的表達(dá)將“三明治”培養(yǎng)1、2、3、4 d的大鼠肝細(xì)胞及大鼠肝組織勻漿，冰上裂解后，離心，取上清液，用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。煮沸5 min，SDS-PAGE分離后，將蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，奶粉封閉，漂洗后分別加入P-gp(1 ∶800)、Mrp2(1 ∶600)一抗，4℃孵育過夜，漂洗后再加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h，漂洗后ECL曝光成像。用Image-Pro Plus 6.0 軟件分析，以目的蛋白的積分光密度(integral optical density，IOD)/內(nèi)參GAPDH的IOD的比值作為蛋白的表達(dá)量。

1.6累積攝取和膽管外排實(shí)驗(yàn)在“三明治”培養(yǎng)的d 4，將肝細(xì)胞與含Ca2+或無Ca2+的Hanks液預(yù)孵育15 min，分別加入10 μmol·L-1小檗堿、藥根堿、巴馬汀孵育2、5、10、20 min，在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)吸去培養(yǎng)液，并用4℃ Hanks液清洗3次，隨后加入細(xì)胞裂解液150 μL裂解細(xì)胞。取100 μL細(xì)胞裂解液加入50 μL內(nèi)標(biāo)(5 μmol·L-1對乙酰氨基酚)，渦旋混勻，用10%冰醋酸溶液100 μL 酸化，混勻后用3 mL乙醚提取，吸取有機(jī)相2.5 mL，氮?dú)獯蹈?，?00 μL流動相復(fù)溶后離心，上清液5 μL進(jìn)樣分析，UPLC-MS/MS 分別測定小檗堿、藥根堿、巴馬汀在含Ca2+或無Ca2+條件下的細(xì)胞蓄積量。

當(dāng)SCRH在含Ca2+的緩沖液中培養(yǎng)時(shí)，緊密連接完整，攝取進(jìn)入肝細(xì)胞的藥物可在轉(zhuǎn)運(yùn)體作用下外排至膽管，此時(shí)測得的藥物蓄積量為肝細(xì)胞和膽管中的蓄積量；當(dāng)細(xì)胞在無Ca2+的緩沖液中孵育時(shí)，緊密連接遭到破壞，膽管管腔內(nèi)藥物釋放進(jìn)入培養(yǎng)液中，此時(shí)測得的藥物蓄積量僅為肝細(xì)胞的蓄積量。通過兩種不同條件下藥物細(xì)胞蓄積量的差值，可計(jì)算排入膽管的藥量。

1.7P-gp和Mrp2抑制劑對外排的影響培養(yǎng)4 d的SCRH，分為對照組和低、中、高濃度P-gp、Mrp2抑制劑組，換成含Ca2+或無Ca2+的Hanks液預(yù)孵育15 min，在抑制劑組的不同孔內(nèi)分別加入濃度為25、50、100 μmol·L-1的P-gp抑制劑維拉帕米、Mrp2抑制劑丙磺舒孵育20 min，對照組加入空白溶劑，隨后分別加入終濃度為10 μmol·L-1小檗堿、藥根堿、巴馬汀共孵育10 min，孵育結(jié)束后吸去上清液，并用4℃ Hanks液清洗3次，隨后加入150 μL裂解液裂解細(xì)胞，按“1.6”項(xiàng)下方法處理，UPLC-MS/MS分別測定小檗堿、藥根堿、巴馬汀在含Ca2+或無Ca2+條件下的細(xì)胞蓄積量。

1.8色譜和質(zhì)譜條件色譜條件：色譜柱：ACQUITY UPLCTM BEH C18柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)；柱溫：30 ℃；流動相乙腈-水(含0.1%甲酸)=15 ∶85，流速：0.25 mL·min-1；進(jìn)樣量5 μL。

質(zhì)譜條件：離子源為電噴霧離子源(ESI)，正離子多離子反應(yīng)監(jiān)測(MRM)，毛細(xì)管電壓3.2 kV，去溶劑氣溫度500℃，去溶劑氣流速700 L·h-1，錐孔氣流速：150 L·h-1。小檗堿、藥根堿、巴馬汀和內(nèi)標(biāo)對乙酰氨基酚的離子通道分別為m/z 336.1→320.2、m/z 338.2→322.3、m/z 352.2→308.1、m/z 152.2→110.1。

1.9數(shù)據(jù)分析通過下列公式(1)、(2)計(jì)算藥物的膽管外排指數(shù)(biliary excretion index, BEI)和膽汁清除率(CLbile)[6]，公式(1)中Acells+bile是含Ca2+條件下藥物在肝細(xì)胞和膽管中的蓄積量，Acells是無Ca2+條件下藥物在肝細(xì)胞的蓄積量。SCRH在含Ca2+培養(yǎng)液中膽小管保持完整，Acells+bile反映了肝細(xì)胞攝取轉(zhuǎn)運(yùn)體攝取底物的能力； 在無Ca2+條件下，SCRH膽小管的緊密連接被破壞，膽小管中的藥物釋放到上清液中，Acells反映了肝細(xì)胞攝取和外排的凈效應(yīng)，兩者的差值反映肝細(xì)胞外排轉(zhuǎn)運(yùn)體外排底物的量。公式(2)中AUCmedium是底物初始濃度和孵育時(shí)間的乘積，用200 mg蛋白/克肝臟、40 g肝/kg大鼠體重的參數(shù)計(jì)算體外的內(nèi)在膽汁清除率(CLbile)。

公式(1)

公式(2)

2 結(jié)果

2.1SCRH模型P-gp和Mrp2的表達(dá)不同培養(yǎng)時(shí)間的SCRH細(xì)胞中的P-pg、Mrp2轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)情況見Fig 1，SCRH細(xì)胞有P-pg、Mrp2表達(dá)，且隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，P-pg、Mrp2表達(dá)也增加，培養(yǎng)4 d的SCRH細(xì)胞表達(dá)的P-pg、Mrp2與肝組織無明顯差異。表明SCRH模型可用于評價(jià)經(jīng)P-pg、Mrp2介導(dǎo)的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)研究。

Fig 1 Expression of P-gp and Mrp2

*P<0.05,**P<0.01vsliver

2.2UPLC-MS/MS分析方法的確證分別取空白細(xì)胞裂解液、對照品溶液及實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞樣品溶液，按“1.6”項(xiàng)下操作，進(jìn)行UPLC-MS /MS分析，獲得空白細(xì)胞樣品色譜圖(Fig 2A)、空白細(xì)胞裂解液加入對照品溶液色譜圖(Fig 2B)、外排實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞樣品色譜圖 (Fig 2C)。結(jié)果表明，組織中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾小檗堿、藥根堿、巴馬汀及內(nèi)標(biāo)的測定。

配制系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液進(jìn)樣分析，以樣品與內(nèi)標(biāo)的峰面積比為縱坐標(biāo)，藥物濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得相應(yīng)的回歸方程。Tab 1結(jié)果表明，所測成分在各自的線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

吸取空白細(xì)胞裂解液，分別加入對照品溶液和內(nèi)標(biāo)溶液，配制Tab 1中2、4、6 三個濃度的的質(zhì)量控制(QC)樣品各5份，進(jìn)行基質(zhì)效應(yīng)、提取回收率、精密度、穩(wěn)定性考察。小檗堿的基質(zhì)效應(yīng)在91.85%～98.13%之間，提取回收率為82.26%～88.87%，日內(nèi)精密度RSD為1.21%～5.34%，日間精密度RSD為1.55%～5.76%；巴馬汀的基質(zhì)效應(yīng)在95.21%～102.30%之間，提取回收率為79.37%～85.05%，日內(nèi)精密度RSD為2.09%～6.62%，日間精密度RSD為1.86%～6.14%；藥根堿的基質(zhì)效應(yīng)在89.92%～95.62%之間，提取回收率為80.33%～86.70%，日內(nèi)精密度RSD為1.86%～6.38%，日間精密度RSD為1.71%～5.96%；穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)表明3種生物堿樣品室溫下放置24 h、經(jīng)3次凍融循環(huán)以及-70 ℃存放30 d條件下，供試品穩(wěn)定性良好，RSD均小于15%。

2.3小檗堿、巴馬汀、藥根堿在SCRH的累積攝取和膽管外排將小檗堿、巴馬汀、藥根堿分別在有Ca2+或無Ca2+的條件下孵育不同時(shí)間，測定細(xì)胞蓄積量，計(jì)算膽管外排量，考察小檗堿、巴馬汀、藥根堿在有Ca2+或無Ca2+條件下細(xì)胞累積攝取隨時(shí)間的變化。Fig 3結(jié)果表明，隨著孵育時(shí)間的延長，3種生物堿的細(xì)胞蓄積量增加，且在7.5、15、20 min，含Ca2+條件的蓄積量與無Ca2+相比具有明顯差異(P<0.05，P<0.01)，說明3種生物堿均經(jīng)過膽汁外排。小檗堿、巴馬汀、藥根堿孵育10 min的BEI 值分別為(67.54±7.12)%、(33.51±4.27)% 、(43.67±5.51)%，CLbile分別為(24.28±3.04)mL·min-1·kg-1、(4.97±0.59)mL·min-1·kg-1、(4.20±0.52)mL·min-1·kg-1。

2.4轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制劑對小檗堿、巴馬汀、藥根堿外排的影響不同濃度的P-gp抑制劑CsA、Ver和Mrp2抑制劑MK571、PBC對小檗堿、巴馬汀、藥根堿外排的影響見Fig 4。結(jié)果顯示，P-gp抑制劑CsA、Ver均能降低小檗堿、巴馬汀、藥根堿的BEI，且呈濃度依賴性，100 μmol·L-1的CsA分別將小檗堿、巴馬汀、藥根堿的BEI降低至對照組的31.01%、26.97%、36.44%，100 μmol·L-1的Ver分別將小檗堿、巴馬汀、藥根堿的BEI降低至對照組的34.73%、31.50%、41.96%。不同濃度的Mrp2抑制劑MK571、PBC對小檗堿、巴馬汀、藥根堿的BEI均無明顯影響。表明P-gp 可能介導(dǎo)了小檗堿、巴馬汀、藥根堿的膽汁外排，Mrp2未參與小檗堿、巴馬汀、藥根堿的轉(zhuǎn)運(yùn)。

Tab 1 Liner relationships of three components(±s, n=5)

Fig 2 Typical UPLC-MS /MS chromatograms

A: Blank cell suspension; B: Blank cell suspension spiked with standards and IS; C: SCRH cell sample; 1: Berberine; 2: Palmatine; 3: Jateorhizine ; 4: Paracetamol (IS)

3 討論

有些藥物進(jìn)入肝臟后，以原形或代謝產(chǎn)物的形式，通過膽小管膜上外排轉(zhuǎn)運(yùn)體外排進(jìn)膽汁，然后排至腸道，外排轉(zhuǎn)運(yùn)體對藥物在肝臟的清除至關(guān)重要。外排轉(zhuǎn)運(yùn)體分布在肝臟膽小管側(cè)，主要有P-gp、MRP2、乳腺癌耐藥相關(guān)蛋白、膽鹽輸出泵等，介導(dǎo)多種內(nèi)源性物質(zhì)及外源性藥物的膽汁排泄過程[7]，在這些轉(zhuǎn)運(yùn)體中研究較多的是P-gp和MRP2。

P-gp由多藥耐藥性基因MDR1編碼，為典型的外排轉(zhuǎn)運(yùn)體，在體內(nèi)分布廣泛, 不僅在肝臟的膽小管面上，在小腸、胎盤以及大腦毛細(xì)血管上皮細(xì)胞的腔膜側(cè)均有不同水平的表達(dá)。P-gp的底物范圍廣泛，能將在結(jié)構(gòu)和化學(xué)性質(zhì)上相差很遠(yuǎn)的多種化合物阻擋在細(xì)胞之外。盡管P-gp 在體內(nèi)不同組織均有分布，不管是通過阻礙吸收還是加速排泄，它的作用均表現(xiàn)為降低底物藥物在體內(nèi)的暴露量[8]。因此，當(dāng)體內(nèi)P-gp 的功能被抑制時(shí)，藥物在組織的分布濃度將提高，相反，當(dāng)P-gp 的表達(dá)被誘導(dǎo)時(shí)，藥物在組織的分布濃度將降低。典型的P-gp抑制劑包括維拉帕米、環(huán)孢素A、紅霉素、酮康唑等。MRP2是ABCC 外排轉(zhuǎn)運(yùn)體家族中的一員，在不同組織中MRP2 均表達(dá)于細(xì)胞的腔膜側(cè)，將底物從組織向外轉(zhuǎn)運(yùn)。MRP2 有較寬的內(nèi)源性和外源性的底物譜，如膽紅素的葡糖醛酸結(jié)合物、類固醇激素的葡糖醛酸或硫酸結(jié)合物、藥物的II 相代謝物等[9]?？鼓[瘤藥物如甲氨蝶呤、長春新堿以及順鉑也能被MRP2 轉(zhuǎn)運(yùn)。MRP2的抑制劑包括MK571、丙磺舒、吲哚美辛等。因此，本研究選擇維拉帕米、環(huán)孢素A作為P-gp的特異性抑制劑，選擇MK571、丙磺舒作為MRP2的特異性抑制劑，評價(jià)小檗堿、巴馬汀、藥根堿是否經(jīng)P-gp、MRP2外排進(jìn)入膽汁。

原代肝細(xì)胞來源于肝組織，可表達(dá)肝臟藥物代謝酶和轉(zhuǎn)運(yùn)體，被應(yīng)用于藥代動力學(xué)的體外研究，如評價(jià)經(jīng)肝藥物轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝、毒性及藥物相互作用等。雖然原代肝細(xì)胞可模擬肝臟的基本功能，然而，不同方式培養(yǎng)的細(xì)胞功能和應(yīng)用卻不盡相同。單層貼壁培養(yǎng)的原代肝細(xì)胞保持了正常肝細(xì)胞的生物學(xué)特性，卻喪失了細(xì)胞原有的極性，且隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，代謝酶和轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)迅速減少，常用于藥效和毒性實(shí)驗(yàn)[10]。懸浮培養(yǎng)的肝細(xì)胞完整地表達(dá)轉(zhuǎn)運(yùn)體和代謝酶的功能活性，且藥物與細(xì)胞的接觸面積充足，常用于藥物的攝取研究[11]。貼壁或懸浮培養(yǎng)的肝細(xì)胞會迅速喪失極性，不能形成膽管，難以模擬體內(nèi)肝臟的膽汁外排功能。

Fig 3 Accumulation and BEI of berberine, palmatine and jateorhizine in SCRH (±s, n=6)

*P<0.05,**P<0.01vscell+bile at the same time

三明治培養(yǎng)是將肝細(xì)胞培養(yǎng)于兩層膠原之間，底層的鼠尾膠原使肝細(xì)胞易于貼壁，上層的Matrigel基質(zhì)膠使其形成肝板樣結(jié)構(gòu)，并維持肝細(xì)胞極化狀態(tài)(包括血管側(cè)膜和膽管側(cè)膜)，使肝細(xì)胞的生長接近體內(nèi)生理狀況，培養(yǎng)后肝細(xì)胞可形成完整的膽小管網(wǎng)絡(luò)并保持緊密連接，常用于藥物的肝膽排泄研究[12]。SCRH與目前常用的Caco-2、MDCK等細(xì)胞模型相比，能更好地模擬體內(nèi)環(huán)境，可考察肝臟轉(zhuǎn)運(yùn)體與肝臟藥物代謝酶的作用[13]，尤其是用于預(yù)測藥物的膽汁排泄，具有獨(dú)特的優(yōu)勢。

Fig 4 Effect of P-gp and Mrp2 inhibitors on BEI of berberine, palmatine and jateorhizine(±s, n=6)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group

本實(shí)驗(yàn)在確證培養(yǎng)至d 4，SCRH細(xì)胞模型表達(dá)P-gp和Mrp2轉(zhuǎn)運(yùn)體的基礎(chǔ)上，考察含Ca2+或無Ca2+條件下小檗堿、巴馬汀、藥根堿的藥物蓄積量，計(jì)算BEI和CLbile。結(jié)果表明，肝細(xì)胞中的小檗堿、巴馬汀、藥根堿均經(jīng)過膽汁排泄；進(jìn)一步觀察P-gp和Mrp2抑制劑對小檗堿、巴馬汀和藥根堿外排的影響發(fā)現(xiàn)，不同濃度的P-gp抑制劑CsA、Ver均能降低小檗堿、巴馬汀、藥根堿的BEI，且呈濃度依賴性，而Mrp2抑制劑MK571、PBC對小檗堿、巴馬汀、藥根堿的膽汁排泄均無明顯影響，說明P-gp 可能介導(dǎo)了小檗堿、巴馬汀、藥根堿的膽汁外排，Mrp2未參與小檗堿、巴馬汀、藥根堿向膽汁的排泄。本實(shí)驗(yàn)為研究相關(guān)藥物的在肝臟的排泄奠定了基礎(chǔ)，為進(jìn)一步分析藥物在體內(nèi)的處置提供了依據(jù)。

(致謝: 本實(shí)驗(yàn)在河南省中醫(yī)藥研究院中藥研究所藥理實(shí)驗(yàn)室完成，非常感謝實(shí)驗(yàn)室各位老師和同學(xué)在實(shí)驗(yàn)技術(shù)上的無私幫助。)

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