肝X受體激活對全腦缺血/再灌注小鼠海馬神經(jīng)干細胞增殖及認知功能的影響

陳莉莉，楊雪梅，諶貝貝，承歐梅

(重慶醫(yī)科大學(xué) 1. 附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科、2. 藥理學(xué)院，重慶 400016)

全腦缺血引發(fā)海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元的大量死亡，常導(dǎo)致認知和記憶功能缺損。成年哺乳動物海馬齒狀回(dentate gyrus，DG)中的神經(jīng)干細胞(neural stem cell, NSC)可以產(chǎn)生新生的神經(jīng)元，并整合到神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中，從而改善全腦缺血后小鼠的認知功能[1]。然而，內(nèi)源性神經(jīng)發(fā)生的NSC數(shù)量遠遠不足，且其存活率也不高，就需要擴大內(nèi)源性的神經(jīng)發(fā)生。肝X受體(liver X receptor, LXR)是核受體家族成員中重要的一員，有α和β兩種亞型。LXRα主要在脂類代謝有關(guān)的器官高表達，LXRβ幾乎在所有的組織和器官內(nèi)表達，尤其在腦。研究表明，TO901317能夠非選擇性地激活LXRα和LXRβ，其激活后能夠使LXR的目標(biāo)基因ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白A1(ATP-binding cassette transporter A1,ABCA1)表達增加。激活后的LXR具有調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、抑制炎癥、促進神經(jīng)保護、促進神經(jīng)發(fā)生的作用[2-3]。神經(jīng)發(fā)生包括NSC的增殖、遷移、分化、存活等諸多復(fù)雜的環(huán)節(jié)，并受到一些分子機制的調(diào)控。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)能夠促進細胞的增殖、分化、存活等，在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生、發(fā)育過程中有重要的作用，同時在神經(jīng)系統(tǒng)損傷的情況下具有神經(jīng)保護與修復(fù)的作用[4]，且BDNF能夠促進內(nèi)源性NSC的神經(jīng)發(fā)生[5]。而BDNF基因轉(zhuǎn)錄的啟動是由于細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular signal-regulated protein kinase, ERK)的磷酸化，從而激活環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)原件結(jié)合蛋白(cyclic AMP response element binding protein, CREB)而發(fā)生。因此，本課題探討LXR激活對全腦缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)小鼠海馬齒狀回NSC的增殖與認知功能的影響，其機制是否與激活ERK1/2-CREB-BDNF信號通路有關(guān)，從而促進I/R小鼠海馬DG區(qū)內(nèi)源性神經(jīng)發(fā)生。

1 材料

1.1試劑TO901317(純度99%)、5-溴脫氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2-deoxyuridine，BrdU，純度99%)均購自Sigma公司；兔抗BrdU單克隆抗體、兔抗雙皮質(zhì)素(doublecortin，DCX)單克隆抗體、兔抗p-CREB多克隆抗體、兔抗LXRα多克隆抗體、兔抗LXRβ多克隆抗體，均購自美國Abcam公司；兔抗p-ERK1/2、t-ERK1/2、t-CREB多克隆抗體(萬類生物公司)；兔抗BDNF多克隆抗體(武漢三鷹公司) ;兔抗ABCA1多克隆抗體(美國Immunoway公司)；鼠抗β-actin多克隆抗體 (北京博奧森公司)。

1.2儀器Morris水迷宮系統(tǒng)(淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司)；凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad，美國)；全自動酶標(biāo)儀(Spectra Max M2，美國)；光學(xué)顯微鏡(Nikon，日本)；激光共聚焦顯微鏡(Nikon A1+R，日本)。

2 方法

2.1實驗動物與分組成年♂ C57BL/6小鼠( SPF級)，購自重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。75只♂ C57小鼠，體質(zhì)量(24±2) g，隨機分為假手術(shù)組(Sham組)、全腦缺血/再灌注組(I/R組)、全腦缺血/再灌注+TO901317組(I/R+TO90組) ，每組25只。其中Morris水迷宮實驗各組6只，HE染色各組5只，免疫組化各組5只，免疫熒光各組5只，Western blot檢測各組4只。

2.2小鼠雙側(cè)頸總動脈夾閉(bilateralcommoncarotidarteryocclusion，BCCAO)模型的制備[6]3.5%水合氯醛進行腹腔注射麻醉后，分離左、右頸總動脈，用動脈夾夾閉雙側(cè)頸總動脈20 min，然后取下動脈夾，進行縫合。Sham組不用動脈夾夾閉，只需要對其進行分離。

2.3實驗動物的給藥將TO901317溶解于二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)中，I/R+TO90組造模后24 h采用TO901317腹腔注射，劑量30 mg·kg-1，每天1次，連續(xù)14 d。Sham組和I/R組在相同時候給予同體積的DMSO腹腔注射。造模后9～12 d各組小鼠腹腔注射BrdU(50 mg·kg-1)，每天1次，持續(xù)4 d。

2.4行為學(xué)測試[1]各組選擇6只小鼠在再灌注后d 28進行Morris水迷宮實驗。小鼠在水迷宮的4個象限中游泳，Morris水迷宮直徑120 cm、高45 cm，里面有直徑10 cm的平臺1個，位于水面下1 cm。各象限為小鼠進行Morris水迷宮實驗時的入水點，用電腦記錄實驗數(shù)據(jù)。訓(xùn)練d 1讓小鼠在平臺上適應(yīng)60 s，然后將小鼠放入水中，讓其游至平臺，60 s內(nèi)沒有找到隱藏平臺者，由實驗者將該小鼠引導(dǎo)至隱藏平臺停留30 s，然后終止該小鼠實驗。d 2～5小鼠分別由4個象限沿水池壁入水訓(xùn)練，記錄其找到隱藏平臺的時間，如果超過60 s則按照60 s計算。d 6移去隱藏在水下的平臺，將小鼠放入水中，記錄60 s內(nèi)各小鼠在原平臺所在象限內(nèi)的跨臺次數(shù)。

2.5HE染色觀察組織病理學(xué)形態(tài)再灌注后7 d，各組選擇5只小鼠進行HE染色，染色后，在顯微鏡下觀察各組小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化，在400倍顯微鏡下隨機取非重疊視野5個，并對CA1區(qū)正常神經(jīng)元進行計數(shù)，計算出每只小鼠海馬CA1區(qū)400倍視野下正常神經(jīng)元的個數(shù)。

2.6免疫組織化學(xué)檢測DCX陽性細胞數(shù)目各組選擇5只小鼠。用免疫組化方法檢測海馬DG區(qū)DCX陽性細胞的表達(DCX標(biāo)記新生的神經(jīng)元)，按試劑盒說明書逐項操作。DCX陽性細胞呈棕黃色，切片的選擇及細胞計數(shù)的方法同HE染色，計算每只小鼠海馬DG區(qū)每個高倍鏡視野下的平均DCX陽性細胞數(shù)。

2.7BrdU免疫熒光各組選5只小鼠。I/R后14 d，水合氯醛麻醉小鼠后心臟灌注，腦組織用蔗糖溶液進行梯度脫水，后冠狀切片厚10 μm。50%甲酰胺65℃修復(fù)后加鹽酸、硼酸等處理30 min。山羊血清封閉，加BrdU一抗( 1 ∶200，PBS陰性對照)，4℃過夜。加二抗37℃ 1 h，DAPI染色5 min，甘油封片。觀察海馬DG區(qū)BrdU陽性細胞。應(yīng)用Image-pro plus6.0進行圖像分析。

Tab 1 The escape latency and number of crossings in each group (±s, n=6)

*P<0.05,**P<0.01vssham;#P<0.05，##P<0.01vsI/R

2.8Westernblot檢測各組選擇4只小鼠。I/R后14 d，3.5%水合氯醛麻醉小鼠后斷頭取腦，在冰上迅速用彎鑷分離出小鼠的雙側(cè)海馬，立刻放在液氮里。經(jīng)過電泳、電轉(zhuǎn)、封閉等步驟后，加一抗p-ERK1/2(1 ∶300)、t-ERK1/2(1 ∶500)、p-CREB(1 ∶800)、t-CREB(1 ∶1 000)、BDNF(1 ∶1 000)、LXRα(1 ∶300)、LXRβ(1 ∶500)、ABCA1(1 ∶1 000)、β-actin(1 ∶1 000)， 4℃孵育過夜。加二抗(1 ∶3 000)，顯影。用Fusion軟件分析。

3 結(jié)果

3.1LXR激活對全腦I/R小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響在d 1～5的定位航行實驗中，各組小鼠找到水下平臺的時間隨著天數(shù)的增加均逐漸減少。與Sham組比較，I/R組小鼠找到隱藏平臺的時間明顯延長(P<0.05，P<0.01)；與I/R組比較，I/R+TO90組小鼠找到隱藏平臺的時間明顯縮短(P<0.01)。在空間探索實驗中，Sham組和I/R+TO90組小鼠穿越原平臺所在象限的次數(shù)均明顯高于I/R組(P<0.01)。表明在全腦缺血后，激活LXR能夠改善小鼠受損的學(xué)習(xí)記憶等認知功能，見Tab 1、Fig 1。

Fig 1 Typical trajectories of place navigation test

3.2全腦I/R小鼠海馬CA1區(qū)病理學(xué)變化Fig 2 HE染色可見，Sham組小鼠海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元結(jié)構(gòu)清晰，排列緊密，核圓形，染色清晰，呈深藍色；而I/R組和I/R+TO90組神經(jīng)元結(jié)構(gòu)不規(guī)則，出現(xiàn)明顯核固縮，排列松散，神經(jīng)細胞數(shù)目明顯減少(P<0.01)。說明所造模型成功可靠，并且穩(wěn)定。

Fig 2 Pathology of hippocampal CA1 region in mice afterI/R 7 days observed by HE staining (× 400)

A: Microphotographs showed the histological changes of CA1 region in hippocampal; B: Histograms showed the numbers of CA1 neurons in hippocampal.**P<0.01vssham group;#P< 0.05vsI/R group

3.3LXR激活對全腦缺血小鼠海馬DCX陽性細胞的影響免疫組化檢測小鼠海馬DCX陽性細胞的表達，如Fig 3A、3B所示，Sham組和I/R組小鼠海馬DG區(qū)可見少量的DCX陽性細胞；而I/R陽性TO90組小鼠DCX陽性細胞沿海馬DG區(qū)分布，且較Sham組和I/R組的DCX陽性細胞明顯增多(P<0.01)。

3.4LXR激活對全腦缺血小鼠海馬BrdU陽性細胞的影響免疫熒光檢測小鼠海馬BrdU陽性細胞的表達，如Fig 3C、3D所示，Sham組小鼠海馬DG區(qū)僅見少量的BrdU陽性細胞; I/R組海馬DG區(qū)較Sham組出現(xiàn)較多BrdU陽性細胞(P<0.01)；給予I/R小鼠LXR激動劑TO901317處理后，海馬DG區(qū)BrdU陽性細胞數(shù)明顯增多(P<0.01)。

3.5LXR激活對LXRα、LXRβ、ABCA1蛋白表達的影響如Fig 4所示，3組小鼠海馬內(nèi)均有LXRα、LXRβ、ABCA1蛋白的表達，LXRα與LXRβ在3組間沒有太大變化，而ABCA1在I/R+TO90組中的表達呈明顯上升趨勢(P<0.05，P<0.01)。說明非選擇性LXR激動劑TO901317引起了LXRα和LXRβ在腦內(nèi)的激活，使下游基因ABCA1的表達明顯增加。

Fig 3 Effect of LXR activation on BrdU+ and DCX+ cellsin hippocampus of mice with global cerebral ischemia (±s, n=5)

A, B: Effect of LXR activation on hippocampal DCX+ cells in mice with global cerebral ischemia (immunohistochemistry, ×400); C,D: Effect of LXR activation on hippocampal BrdU+ cells in global cerebral ischemia mice (immunofluorescence, ×200).*P<0.05,**P<0.01vssham group;##P<0.01vsI/R group

3.6LXR激活對全腦缺血小鼠海馬p-ERK1/2、t-ERK1/2、p-CREB、t-CREB、BDNF蛋白表達的影響如Fig 5所示，3組小鼠海馬內(nèi)均有t-ERK1/2和t-CREB蛋白的表達，但各組間無統(tǒng)計學(xué)意義。Sham組小鼠海馬p-ERK1/2和p-CREB蛋白表達較低，與Sham組相比，I/R組小鼠海馬p-ERK1/2和p-CREB蛋白表達水平增加(P<0.05)。與I/R組相比，使用LXR激動劑TO901317干預(yù)后，I/R+TO90組p-ERK1/2和p-CREB蛋白表達明顯上升(P<0.01)。Sham組小鼠表達少量BDNF蛋白；與Sham組相比，I/R組小鼠海馬BDNF蛋白表達水平增加(P<0.01)，而I/R+TO90組BDNF蛋白的表達水平較I/R組又進一步增加(P<0.01)。

Fig 4 Expression of LXRα, LXRβ and ABCA1 proteinin hippocampus of mice by Western blot (±s, n=4)

**P<0.01vssham group;#P<0.05vsI/R group

4 討論

全腦I/R模型模擬的是臨床上心臟驟停、休克、窒息等疾病發(fā)生、發(fā)展的病理生理過程。小鼠在經(jīng)受I/R后，受損的主要是對缺血比較敏感的海馬，I/R使海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元大量死亡及海馬的功能受損，從而損害了學(xué)習(xí)記憶能力[7]。神經(jīng)發(fā)生是指NSC在一定條件下增殖、分化、遷移，并且參與神經(jīng)功能恢復(fù)的過程。大量研究證實，成年哺乳動物的神經(jīng)發(fā)生存在于海馬DG 和側(cè)腦室室管膜下區(qū)( subventricularzone，SVZ)兩個區(qū)域，從而使認知功能在一定程度上得到改善[8-9]。全腦缺血、睡眠剝奪、運動等能誘導(dǎo)體內(nèi)NSC增殖分化為神經(jīng)元，從而整合到已有的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮其生理功能[10-11]。

我們前期研究發(fā)現(xiàn)，全腦缺血后即刻腹腔注射LXR激動劑可減少炎癥因子的表達，發(fā)揮腦保護作用。另有研究發(fā)現(xiàn)，LXR配體在斑馬魚體內(nèi)可以促進神經(jīng)發(fā)育。值得注意的是，每個配體選擇性地調(diào)節(jié)不同的中腦神經(jīng)元種群的發(fā)育[3]。同時，用氧甾醇激活LXR配體，增加了小鼠胚胎干細胞多巴胺(dopamine,DA)神經(jīng)元的數(shù)量，LXR敲除后，胚胎鼠DA神經(jīng)元的數(shù)量明顯減少，說明LXR可促進胚胎鼠中腦神經(jīng)再生[12]。但LXR激活能否促進全腦缺血小鼠DG區(qū)NSC增殖，從而改善認知功能，目前未見報道。

Fig 5 Expression of p-ERK1/2, t-ERK1/2, p-CREB, t-CREB, BDNF protein in hippocampus of mice by Western blot (±s, n=4)

*P<0.05,**P<0.01vssham group;##P<0.01vsI/R group

本研究結(jié)果表明，在缺血24 h，LXR激活能夠促進全腦缺血小鼠海馬NSC的增殖，能夠使全腦缺血導(dǎo)致的小鼠學(xué)習(xí)、記憶等認知功能缺損得到改善，上調(diào)全腦缺血小鼠海馬p-ERK1/2、p-CREB、BDNF等蛋白的表達。

成年海馬的神經(jīng)發(fā)生受到一系列機制的調(diào)控，其中ERK1/2對細胞的增殖分化有重要作用。ERK1/2磷酸化后的p-ERK對下游轉(zhuǎn)錄因子CREB進行調(diào)控，而CREB在活化后形成p-CREB，p-CREB能夠特異性結(jié)合下游的BDNF編碼基因的啟動子，從而促進BDNF的轉(zhuǎn)錄[13-14]。BDNF是一類對神經(jīng)細胞的增殖、營養(yǎng)、分化等具有重要作用的蛋白質(zhì)。這種營養(yǎng)因子能協(xié)調(diào)生物功能，除了它的醛脫氫酶可塑性過程外，還可以通過異源傳遞的長期作用，促進神經(jīng)元前體細胞的蛋白質(zhì)分化、突觸形成和神經(jīng)元生存[15]。本實驗結(jié)果顯示，LXR激活可能通過激活ERK1/2-CREB-BDNF信號通路，上調(diào)全腦I/R后小鼠海馬BDNF蛋白的表達，促進小鼠海馬NSC的增殖。

綜上，LXR激活可能通過激活ERK1/2-CREB-BDNF信號通路，使BDNF表達升高，進而促進小鼠齒狀回區(qū)海馬NSC的增殖，使全腦I/R后小鼠的認知功能障礙得到改善。

(致謝：本實驗在重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院實驗研究中心完成，感謝實驗研究中心各位老師的指導(dǎo)和幫助。)

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