H2 O2 誘導(dǎo)ARPE-19細(xì)胞損傷模型的建立及藍(lán)莓花青素的保護(hù)作用

吳 寒， HUTABARAT Ruth Paulina， 黃午陽(yáng)

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇 南京 210014)

年齡相關(guān)性黃斑病變 (age-related macular degeneration, AMD) 是一種隨年齡增長(zhǎng)出現(xiàn)的視網(wǎng)膜黃斑部退行性病變，是發(fā)達(dá)國(guó)家最常見(jiàn)的不可逆性致盲眼病。在我國(guó)，50歲以上人群中，AMD是最重要的致盲性疾病之一[1]。一般認(rèn)為，AMD的發(fā)病機(jī)制涉及老化、氧化損傷、炎癥、自身免疫等多種途徑，視網(wǎng)膜色素上皮 (retinal pigment epithelial, RPE) 細(xì)胞是其病理改變各階段的中心環(huán)節(jié)，長(zhǎng)期氧化應(yīng)激導(dǎo)致的RPE結(jié)構(gòu)與功能異常被認(rèn)為是引發(fā)AMD的重要原因[2]。作為眼部組織細(xì)胞代謝最活躍的細(xì)胞，RPE可以吞噬視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞的外界盤(pán)膜，產(chǎn)生大量的脂質(zhì)過(guò)氧化物及H2O2[3]。因此，對(duì)RPE氧化應(yīng)激損傷和保護(hù)進(jìn)行研究，將有利于深入探索AMD的發(fā)病機(jī)制和治療手段。

近年來(lái)，花青素保護(hù)視力研究受到了廣泛關(guān)注，研究者認(rèn)為花青素能夠促進(jìn)視網(wǎng)膜紫質(zhì)合成、減輕氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜細(xì)胞損害[4]。前期研究時(shí)，本課題組從兔眼藍(lán)莓 (Vacciniumashei) 中提取花青素，經(jīng)高效液相色譜 (high performance liquid chromatography, HPLC) 和HPLC-DAD-MS聯(lián)用技術(shù)分析，含有9種花色苷組分[5]，依次為錦葵色素-3-半乳糖苷 (malvidin-3-galactoside, Mv-3-gal)、錦葵色素-3-葡萄糖苷 (malvidin-3-glucoside, Mv-3-glc)、牽牛花色素-3-半乳糖苷 (petunidin-3-galactoside, Pt-3-gal)、牽?；ㄉ?3-葡萄糖苷 (petunidin-3-glucoside, Pt-3-glc)、矢車(chē)菊素-3-半乳糖苷 (cyanidin-3-galactoside, Cy-3-gal)、飛燕草素-3-半乳糖苷 (delphindin-3-galactoside, Dp-3-gal)、飛燕草素-3-葡萄糖苷 (delphindin-3-glucoside, Dp-3-glc)、芍藥素-3-半乳糖苷 (peonidin-3-galactoside, Pn-3-gal) 和錦葵色素-3-阿拉伯糖苷 (malvidin-3-arabinose, Mv-3-ara)，其中Mv-3-gal和Mv-3-glc兩者之和約占花青素總含量的46%?？梢?jiàn)藍(lán)莓中的花青素、錦葵色素含量豐富，為主導(dǎo)成分。目前，關(guān)于藍(lán)莓花青素錦葵色素對(duì)于視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用的報(bào)道十分罕見(jiàn)，鑒于研究必要性，本文選擇自由基引起老化理論的主要因素——H2O2作為誘導(dǎo)劑，建立ARPE-19細(xì)胞損傷模型，用于探究藍(lán)莓花青素錦葵色素的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞株、藥物與試劑人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞系 (ARPE-19)，購(gòu)自廣州吉妮歐生物科技有限公司。兔眼藍(lán)莓， 2016年6月摘于南京市溧水藍(lán)莓種植基地，-18℃凍存；錦葵色素 (Mv)、錦葵色素-3-葡萄糖苷 (Mv-3-glc)、錦葵色素-3-半乳糖苷 (Mv-3-gal)、胰蛋白酶，購(gòu)自美國(guó)Sigma Aldrich公司；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基 (含5.5 mmol·L-1葡萄糖)，購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；青霉素、鏈霉素，購(gòu)自上海Life Technologies公司；活性氧 (reactive oxygen species, ROS) 檢測(cè)試劑盒、MTT細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為市售分析純。

1.2儀器Airtech超凈工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，美國(guó)Thermo公司； TDZ5-WS水平離心機(jī)，上海滬湘儀器有限公司；3K15離心機(jī)，德國(guó)Sigma公司；電子分析天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司；Eyela FDU-1200凍干機(jī)，日本Tokyo Rikakikai公司；Synergy H4微孔板式多功能分析儀 (配有Hyper Terminal Applet ELISA軟件)，美國(guó)Bio Tek公司；DS-Ri2/ECLIPSE Ti-S倒置成像顯微鏡，日本Nikon公司。

1.3方法

1.3.1藍(lán)莓花青素提取[5]稱(chēng)取250 g凍存藍(lán)莓，室溫下解凍并打漿，加入1 L含有1% HCl的甲醇溶液，浸提花青素24 h，每隔2 h混勻1次。浸提液在4℃、5 000×g條件下離心15 min，去除沉淀，40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，按1 ∶1 (V∶V) 比例加入乙酸乙酯，萃取3次。用AB-8型大孔樹(shù)脂純化花青素粗提物，之后凍干，得到藍(lán)莓花青素提取物 (blueberry anthocyanin extract, BAE) 粉末。

1.3.2ARPE-19細(xì)胞培養(yǎng)[6]從液氮中取出ARPE-19凍存管，放于37℃水浴，盡快搖晃解凍，轉(zhuǎn)移凍存液至離心管，25℃、1 000×g離心5 min，棄上清，除去DMSO。用含有10% (V/V) 胎牛血清、1% (V/V) 青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中復(fù)蘇細(xì)胞，再用0.25%胰酶進(jìn)行消化，細(xì)胞計(jì)數(shù)、傳代。選擇生長(zhǎng)良好的3～4代細(xì)胞，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%～90%融合時(shí)，用于實(shí)驗(yàn)。

1.3.3ARPE-19處理

1.3.3.1H2O2誘導(dǎo)ARPE-19細(xì)胞損傷的條件 選擇濃度為0、10、40、80、100、200、400、800、1 600、3 200 μmol·L-1H2O2，分別誘導(dǎo)ARPE-19細(xì)胞2、6、24 h，篩選出H2O2刺激的最佳濃度和時(shí)間。

1.3.3.2BAE對(duì)ARPE-19細(xì)胞的毒性實(shí)驗(yàn) 根據(jù)上述結(jié)果，選擇濃度為0、1、5、10 mg·L-1BAE，分別處理ARPE-19細(xì)胞6、24 h，確定在該濃度范圍內(nèi)、處理時(shí)間下BAE對(duì)細(xì)胞的毒性。

1.3.3.3BAE對(duì)H2O2誘導(dǎo)ARPE-19細(xì)胞損傷模型的保護(hù) 設(shè)立分組：未加入任何藥物的細(xì)胞為空白組；只加入H2O2的細(xì)胞為誘導(dǎo)組；BAE預(yù)處理后，再加入H2O2的細(xì)胞為保護(hù)組。以上分組中，BAE濃度為1、5、10 mg·L-1，保護(hù)時(shí)間為6、24 h；H2O2濃度為800 μmol·L-1，刺激時(shí)間為2、24 h。確定H2O2和BAE的處理時(shí)間，以及BAE用量。

1.3.3.4比較錦葵色素對(duì)H2O2誘導(dǎo)ARPE-19細(xì)胞損傷的保護(hù)作用 按“1.3.3.3”設(shè)立分組，比較BAE、Mv、Mv-3-glc和Mv-3-gal的保護(hù)作用。錦葵色素濃度為5 mg·L-1，保護(hù)時(shí)間為6 h；H2O2濃度為800 μmol·L-1，刺激時(shí)間為2 h。

1.3.4細(xì)胞活力測(cè)定[7]采用MTT法測(cè)定細(xì)胞活力。收集細(xì)胞，制備濃度為1×109·L-1細(xì)胞懸浮液，每孔接種100 μL于96孔板，37℃、5% CO2培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)孔底時(shí)，棄去培養(yǎng)液，換無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)4 h，使細(xì)胞處于同步生長(zhǎng)狀態(tài)。按照“1.3.3”處理細(xì)胞。每孔加入5 g·L-1MTT溶液10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，之后棄去孔內(nèi)溶液。各加入100 μL DMSO，置于搖床上低速振蕩10 min，使紫色結(jié)晶物充分溶解，測(cè)定490 nm處的吸光度 (Abs) 值。以“1.3.3”中未加入任何藥物的細(xì)胞為空白對(duì)照，按下式計(jì)算ARPE-19細(xì)胞活力。

細(xì)胞活力=實(shí)驗(yàn)組Abs值/對(duì)照組Abs值×100%

1.3.5細(xì)胞中ROS水平測(cè)定[8]采用免疫熒光法測(cè)定細(xì)胞ROS水平。收集細(xì)胞，制備濃度為1×109·L-1細(xì)胞懸浮液，每孔接種2 mL于6孔板中，37℃、5% CO2培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)孔底時(shí)，棄去培養(yǎng)液，換無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)4 h，使細(xì)胞處于同步生長(zhǎng)狀態(tài)。按照“1.3.3.4”處理細(xì)胞。棄去上清液，在無(wú)菌條件下裝載DCFH-DA探針，濃度為10 μmol·L-1，于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育20 min。用磷酸鹽緩沖液 (PBS) 洗滌細(xì)胞3次，充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。用1 mL PBS收集消化后的細(xì)胞，放入酶標(biāo)儀中，在激發(fā)波長(zhǎng)485 nm、發(fā)射波長(zhǎng)535 nm條件下檢測(cè)熒光強(qiáng)度。ROS水平以熒光強(qiáng)度值 (arbitrary unit, A.U.) 表示，“1.3.3.4”中未加入任何藥物的細(xì)胞為空白對(duì)照，按下式計(jì)算ARPE-19細(xì)胞中ROS相對(duì)含量。

ROS相對(duì)含量=實(shí)驗(yàn)組A.U.值/對(duì)照組A.U.值×100%

2 結(jié)果

2.1H2O2誘導(dǎo)ARPE-19細(xì)胞損傷模型Tab 1為不同濃度、不同處理時(shí)間下，H2O2對(duì)ARPE-19細(xì)胞存活率的影響。結(jié)果表明，隨著H2O2濃度的增大，活細(xì)胞數(shù)量明顯下降，并呈現(xiàn)劑量依賴(lài)效應(yīng)，H2O2濃度越大，細(xì)胞損傷越嚴(yán)重，測(cè)得的存活率依次降低。通常選擇存活率為50%～60%時(shí)的損傷劑濃度為最佳誘導(dǎo)濃度，當(dāng)H2O2濃度為800 μmol·L-1，刺激時(shí)間為2 h或24 h時(shí)，ARPE-19細(xì)胞存活率為62.51%和59.99%，接近該范圍，因此選擇該條件進(jìn)行誘導(dǎo)。

Tab 1 Effects of different concentrations and stimulatedtime of H2O2 on cell viability

*P<0.05,**P<0.01vsgroup without H2O2in each stimulated time

2.2BAE對(duì)ARPE-19細(xì)胞的毒性檢測(cè)MTT法測(cè)定不同濃度BAE作用細(xì)胞6、24 h后，細(xì)胞存活率的變化情況。由Tab 2可以看出，0～10 mg·L-1的BAE作用ARPE-19細(xì)胞后，細(xì)胞存活率與未加樣品的空白對(duì)照組相比無(wú)明顯減少，在不同處理時(shí)間下，細(xì)胞的存活率差異也無(wú)顯著性，甚至5 mg·L-1BAE預(yù)處理6 h可以改善細(xì)胞生長(zhǎng)，提高存活率 (P<0.01)。結(jié)果表明，在所選濃度范圍內(nèi)，花青素對(duì)ARPE-19細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)毒性，是其發(fā)揮對(duì)細(xì)胞損傷保護(hù)作用的前提。

Tab 2 Effects of different concentrations and mediatedtime of BAE on cell viability

**P<0.01vsgroup without BAE in each mediated time

2.3BAE對(duì)H2O2誘導(dǎo)ARPE-19細(xì)胞損傷模型的保護(hù)作用如Fig 1所示，1、5、10 mg·L-1BAE預(yù)處理ARPE-19細(xì)胞6 h (模型A)和24 h (模型B)，分別以800 μmol·L-1H2O2再刺激2 h (模型A) 和24 h (模型B)，處理后的細(xì)胞較未加入BAE保護(hù)的細(xì)胞在存活率上有明顯區(qū)別。模型A中，H2O2誘導(dǎo)使細(xì)胞存活率降低38.50% (P<0.01)，經(jīng)5、10 mg·L-1BAE保護(hù)后，細(xì)胞存活率明顯提高，分別達(dá)到86.57% (P<0.01) 和76.59% (P<0.05)；模型B中，H2O2誘導(dǎo)使細(xì)胞存活率降低23.10% (P<0.01)，但1～10 mg·L-1BAE對(duì)ARPE-19細(xì)胞的保護(hù)作用不明顯，可能是由于長(zhǎng)時(shí)間的損傷難以修復(fù)。因此，以藍(lán)莓花青素濃度5 mg·L-1，預(yù)處理時(shí)間6 h；H2O2刺激濃度800 μmol·L-1，刺激時(shí)間2 h作為條件，進(jìn)一步探究藍(lán)莓花青素主成分錦葵色素及其糖苷對(duì)H2O2誘導(dǎo)ARPE-19細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。

Fig 1 Effects of different treatments on growth of ARPE-19

Model A:Cells were incubated in BAE for 6 h, and then 800 μmol·L-1H2O2for 2 h; Model B: cells were incubated in BAE for 24 h, and then 800 μmol·L-1H2O2for 24 h.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group without BAE and H2O2;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group without BAE.

2.4錦葵色素對(duì)H2O2誘導(dǎo)ARPE-19細(xì)胞損傷模型的保護(hù)作用根據(jù)上述結(jié)果建立H2O2誘導(dǎo)ARPE-19細(xì)胞氧化損傷模型，比較BAE、Mv、Mv-3-glc和Mv-3-gal對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用，采用MTT法和免疫熒光法分別測(cè)定ARPE-19細(xì)胞的存活率及ROS水平。如Fig 2A所示，800 μmol·L-1H2O2刺激2 h后，細(xì)胞存活率明顯下降36.31% (P<0.01)，藍(lán)莓花青素提取物和錦葵色素可以明顯抑制細(xì)胞氧化損傷，提高ARPE-19細(xì)胞存活率。5 mg·L-1BAE、Mv、Mv-3-gal和Mv-3-glc預(yù)處理6 h后，細(xì)胞存活率分別達(dá)到86.57%、115.72%、98.15%和127.97%，其中錦葵色素糖苷 (Mv-3-glc、Mv-3-gal) 的保護(hù)作用比BAE和Mv更為明顯。由于高濃度H2O2可以誘導(dǎo)產(chǎn)生氧化應(yīng)激，ARPE-19細(xì)胞在800 μmol·L-1H2O2刺激下的ROS水平明顯高于對(duì)照組 (P<0.01)，見(jiàn)Fig 2B。經(jīng)過(guò)5 mg·L-1藍(lán)莓花青素預(yù)處理，BAE、Mv、Mv-3-gal和Mv-3-glc對(duì)H2O2誘導(dǎo)產(chǎn)生的ROS分別抑制26.66%、48.56%、39.47%和 58.04%?；ㄇ嗨劐\葵色素及其糖苷對(duì)氧化應(yīng)激下產(chǎn)生ROS的抑制作用 (P<0.01) 比藍(lán)莓花青素提取物更為明顯 (P<0.05)，Mv-3-gal使細(xì)胞中ROS水平甚至低于空白對(duì)照組 (P<0.05)，其抗氧化能力最強(qiáng)，說(shuō)明錦葵色素及其糖苷是藍(lán)莓花青素提取物中發(fā)揮抗氧化損傷的主要物質(zhì)。

Fig 2 Effects of different treatments on growthand ROS level of ARPE-19

A:Cell viability; B: ROS relative content.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group without BAE and H2O2;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group without BAE.

3 討論

花青素是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最有效的天然水溶性自由基清除劑，其淬滅超氧陰離子自由基的能力是維生素C的20倍、維生素E的50倍。通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，花青素可以穿過(guò)血-腦水屏障和血-視網(wǎng)膜屏障被眼組織吸收，并以完整的形式存在[9]。之前研究表明，藍(lán)莓中的花青素含量在各類(lèi)水果蔬菜中排名第1，兔眼藍(lán)莓中錦葵色素含量占花青素總量最多，主要以葡萄糖苷和半乳糖苷形式存在[5]。根據(jù)相關(guān)報(bào)道，在H2O2誘導(dǎo)RPE細(xì)胞氧化損傷過(guò)程中，從細(xì)胞膜出泡到細(xì)胞凋亡，以及RPE細(xì)胞連接遭到破壞，誘發(fā)了一系列病理反應(yīng)，這一氧化應(yīng)激過(guò)程參與了許多嚴(yán)重眼底疾病 (如老年性黃斑變性、視網(wǎng)膜靜脈阻塞等) 的發(fā)病[2-3]。因此，作為活性氧中間產(chǎn)物之一，H2O2常被用于誘導(dǎo)RPE細(xì)胞的氧化損傷。本文研究了不同濃度H2O2、不同刺激時(shí)間對(duì)ARPE-19細(xì)胞活力的影響，確定最佳H2O2用量和時(shí)效，構(gòu)建了RPE細(xì)胞損傷模型，并初步探討了藍(lán)莓花青素粗提物以及其主要成分錦葵色素、錦葵色素-3-葡萄糖苷、錦葵色素-3-半乳糖苷對(duì)RPE細(xì)胞的保護(hù)及減緩氧化損傷的作用。

結(jié)果表明，藍(lán)莓花青素可以抑制H2O2誘導(dǎo)的ARPE-19細(xì)胞損傷，減少細(xì)胞內(nèi)氧自由基，提高細(xì)胞存活率。這與花青素以下幾方面的作用十分相關(guān)[10-11]：① 有效清除誘發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的羥自由基及反應(yīng)中間產(chǎn)物脂質(zhì)過(guò)氧化自由基、烷自由基，阻斷自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；② 激活視網(wǎng)膜酶，活化和促進(jìn)視紅素的再合成；③ 調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜血液微循環(huán)、加速物質(zhì)代謝交換，加強(qiáng)對(duì)毛細(xì)血管的保護(hù)作用。此外，Milbury等[12]從越橘中提取花青素及其他酚類(lèi)物質(zhì)，對(duì)RPE細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，之后進(jìn)行氧化損傷實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)越橘花青素提取物可以上調(diào)抗氧化酶HO-1和GST-pi的表達(dá)，使細(xì)胞損傷程度明顯小于對(duì)照組。張震等[13]采用1 mmol·L-1H2O2誘導(dǎo)BGC-823細(xì)胞，比較藍(lán)莓花青素預(yù)處理對(duì)細(xì)胞氧化損傷的影響，表明6.25～100 mg·L-1藍(lán)莓花青素提取物能夠明顯提高BGC-823細(xì)胞的存活率，抑制細(xì)胞中ROS生成，對(duì)H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷起到保護(hù)作用。

ROS是生物體內(nèi)重要的生物信號(hào)傳導(dǎo)介質(zhì)，廣泛參與各種正常生理和病理過(guò)程。本研究中，H2O2誘導(dǎo)產(chǎn)生過(guò)多或無(wú)法迅速消除的ROS，使RPE細(xì)胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，導(dǎo)致了機(jī)體中蛋白質(zhì)破碎、DNA損傷和脂質(zhì)過(guò)氧化。研究表明，花青素可以通過(guò)提高超氧化物歧化酶 (superoxide dismutase, SOD)、過(guò)氧化氫酶 (catalase, CAT)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶 (glutathione peroxidase, GSH-Px)等體內(nèi)抗氧化酶活力，降低細(xì)胞中的ROS水平[14]。Teng等[15]還證明，飛燕草素、矢車(chē)菊素和天竺葵素的花色苷能夠阻斷MAPKs相關(guān)通路，如ERK1/2和p38MAPK信號(hào)通路，以及使Akt磷酸化，促進(jìn)Akt信號(hào)通路中p-Akt/Akt增加，使細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶的表達(dá)上調(diào)，從而減少ROS水平。本文發(fā)現(xiàn)的藍(lán)莓花青素對(duì)視網(wǎng)膜細(xì)胞的保護(hù)作用，證實(shí)了藍(lán)莓護(hù)眼和預(yù)防眼科疾病的功能，為研究藍(lán)莓花青素預(yù)防氧化應(yīng)激引起的AMD作用機(jī)制提供了基礎(chǔ)，明確了視網(wǎng)膜病變治療的新方向。下一步我們還將繼續(xù)探究藍(lán)莓花青素錦葵色素對(duì)不同內(nèi)源性抗氧化酶活力的影響，以及是如何通過(guò)調(diào)控MAPKs和Akt信號(hào)通路發(fā)揮保護(hù)作用的，進(jìn)一步闡明藍(lán)莓花青素對(duì)RPE細(xì)胞抗氧化損傷的保護(hù)機(jī)制。

(致謝：本文實(shí)驗(yàn)在江蘇省農(nóng)產(chǎn)品工程技術(shù)研究中心平臺(tái)及實(shí)驗(yàn)室同學(xué)協(xié)助下完成，在此表示感謝。)

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