槲皮素通過影響吲哚胺-2,3-雙加氧酶活性抑制HeLa細胞增殖的研究

張 薇，何 龍，劉瀟憶，韓 琴，葛嘯垠

(南京中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院病原與免疫學(xué)系，江蘇 南京 210023)

L-色氨酸是人體必需氨基酸，參與蛋白質(zhì)以及一些重要生理物質(zhì)代謝。最近研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細胞過度代謝色氨酸，其代謝產(chǎn)物犬尿氨酸可以促進腫瘤細胞生長遷移，并能抑制抗腫瘤免疫應(yīng)答，且色氨酸代謝與腫瘤惡化程度及預(yù)后明顯相關(guān)[1]。吲哚胺-2,3-雙加氧酶(indoleamine-2,3-dioxygenase，IDO)是催化色氨酸生成犬尿氨酸的關(guān)鍵蛋白酶，且IDO對于免疫系統(tǒng)的調(diào)控也非常重要[2-4]。目前，已進入抗腫瘤臨床試驗階段的IDO抑制劑主要包括INCB024360、NLG-919、1-MT等[5-7]。

槲皮素是一種多羥基黃酮類化合物(結(jié)構(gòu)式見Fig 1)，其藥理作用廣泛，對多種惡性腫瘤均有抑制其生長的作用[8-10]。據(jù)報道，槲皮素能夠抑制LPS誘導(dǎo)的THP-1細胞中犬尿氨酸的產(chǎn)生，對IDO1有一定的抑制作用[11]。本研究從細胞水平、體外酶催化活性反應(yīng)等多方面進一步確證了槲皮素對IDO1活性和色氨酸代謝的抑制作用，這可能是槲皮素抑制HeLa細胞增殖的機制之一。該研究為槲皮素抗腫瘤提供了又一理論依據(jù)，而且可以為指導(dǎo)臨床婦科用藥，特別是為更年期婦女保健及宮頸癌等腫瘤患者的用藥提供參考。

Fig 1 Chemical structure of quercetin

1 材料與方法

1.1細胞株人宮頸癌HeLa細胞、人宮頸上皮永生化H8細胞均購自ATCC。

1.2試劑DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶(美國Gibco公司)；槲皮素、3-(N-嗎啉基)丙磺酸[3-(N-morpholino) propanesulfonic acid，MOPS]、抗壞血酸、L-色氨酸、過氧化氫酶、亞甲基藍、三氯乙酸、對二甲基氨基苯甲醛、L-犬尿氨酸、免疫印跡及其他所需試劑等，均購自Sigma-Aldrich；CCK-8試劑盒、細胞周期檢測試劑盒，購自碧云天生物技術(shù)公司；人IFN-γ購自北京義翹神州生物技術(shù)有限公司；抗His抗體購自Cell Signaling Technology；引物由南京金斯瑞設(shè)計合成；RNA提取、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega)；SYBR Green mix(日本TOYOBO)。

1.3儀器FACS CaliburTM流式細胞儀(Becton Dickinson公司)，高效液相色譜儀STI-501 plus(配備N2000色譜工作站，杭州賽智公司)，C1000實時熒光定量PCR系統(tǒng)、垂直板電泳儀(美國Bio-Rad公司)，Spectra Max 250酶標(biāo)儀(美國Molecular Devices公司)，F(xiàn)lour Chem-FC2成像系統(tǒng)(美國Alpha Innotech)。

1.4細胞培養(yǎng)HeLa細胞置于DMEM培養(yǎng)基(10%胎牛血清)中，于37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。傳代時，用PBS洗滌2次，胰蛋白酶消化3 min，300×g離心5 min，更換新鮮的完全培養(yǎng)基。

1.5CCK-8法檢測細胞增殖HeLa細胞接種于96孔板中，加入不同濃度的槲皮素，于37℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，設(shè)置未處理的正常對照組以及未加CCK-8的背景空白組，酶標(biāo)儀450 nm處檢測其吸光值(A)。用以下公式計算細胞相對存活率：細胞相對存活率=(A處理組-A空白組)/(A對照組-A空白組)×100%。

1.6流式細胞術(shù)檢測細胞周期5×105個HeLa細胞接種于培養(yǎng)皿中，待細胞貼壁后，更換無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h，使細胞統(tǒng)一在G0期，再更換完全培養(yǎng)基，加入不同濃度的槲皮素，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。收細胞，加入預(yù)冷的體積分數(shù)為0.7的乙醇，置于冰箱4℃過夜，棄去乙醇，PBS洗2遍，加入碘化丙啶染液(0.03 g·L-1)、RNaseA(0.3 g·L-1)，37℃避光30 min，流式細胞儀檢測細胞周期分布。

1.7qPCR檢測IDO1基因的mRNA表達按照試劑盒說明書操作，提取HeLa細胞的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄，然后用SYBR Green PCR Mix進行qPCR擴增反應(yīng)。每組2個復(fù)孔，重復(fù)3次。結(jié)果以2-ΔΔCt表示實驗組與對照組目的基因表達倍數(shù)關(guān)系，GAPDH作為內(nèi)參基因。本項實驗中用到的引物序列如下：IDO1-F：5′-AGGGTTCTGGGAAGACCCAA-3′，IDO1-R：5′-ATGTCCTCCACCAGCAGTCT-3′；GAPDH-F：5′-CATGTTCGTCATGGGTGTGAAC-3′，GAPDH-R：5′-AGTGATGGCATGGACTGTGGT-3′。

1.8HeLa細胞IDO的誘導(dǎo)表達及犬尿氨酸生成測定5×103個HeLa細胞接種于96孔培養(yǎng)板中，向培養(yǎng)基中加入人IFN-γ(終濃度為0.05 ng·L-1)和不同濃度的槲皮素，處理48 h后，取上清，加入三氯乙酸，50℃孵育30 min。離心去沉淀，加入質(zhì)量體積比為0.02的對二甲氨基苯甲醛(溶劑為醋酸)并混勻，用酶標(biāo)儀在480 nm波長處檢測吸光度。

1.9IDO1蛋白的表達、純化及體外催化反應(yīng)系統(tǒng)將pCMV3-C-His-IDO1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細胞， 48 h后收細胞裂解蛋白，免疫印跡方法檢測IDO1蛋白的表達情況，并用Ni柱純化該蛋白，考馬斯亮藍染色法檢測蛋白純化的效率。IDO1蛋白體外酶活性反應(yīng)實驗的體系如下：2 mmol·L-1色氨酸，20 mmol·L-1抗壞血酸，3.5 μmol·L-1亞甲藍，0.2 ng·L-1過氧化氫酶，10 μL IDO1蛋白裂解液，溶劑為50 mmol·L-1的MOPS緩沖液(pH 6.5)，37°C溫箱中反應(yīng)6 h。

1.10高效液相色譜法(HPLC)檢測色氨酸和犬尿氨酸含量的變化所用色譜柱是Hypersil Gold C8柱(5 μm，150 mm×4.6 mm，Thermo Fisher)。流動相是體積分數(shù)為0.09的乙腈，體積分數(shù)為0.001的乙酸和三氟乙酸。色譜柱的溫度設(shè)定為25℃，流速為0.8 mL·min-1，使用紫外檢測器，色氨酸的檢測波長為280 nm，犬尿氨酸的檢測波長為355 nm。

Fig 2 Inhibition of cell proliferation and cell cycle progression by quercetin in HeLa cells

A,B:Effect of quercetin on cell viability of HeLa cells;C:Quercetin induced cell cycle arrest in HeLa cells.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group

1.11統(tǒng)計學(xué)分析統(tǒng)計學(xué)評估采用Student’sttest(兩組比較)和One-way ANOVA(多組比較)。除非特殊說明，每個實驗至少重復(fù)3次。數(shù)據(jù)用GraphPad Prism進行分析。

2 結(jié)果

2.1槲皮素抑制HeLa細胞的增殖分別用不同濃度的槲皮素處理人宮頸癌HeLa細胞24 h。如Fig 2A所示，與對照組相比，槲皮素對HeLa細胞增殖具有明顯的抑制作用，呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng)；用10 μmol·L-1槲皮素處理HeLa細胞，隨著時間的增長，其抑制效應(yīng)也增強，48 h作用最明顯(Fig 2B)。此外，用不同濃度的槲皮素處理HeLa細胞48 h，流式細胞儀檢測槲皮素對細胞周期的影響，結(jié)果顯示，與對照組相比，槲皮素作用于HeLa細胞48h后，可明顯增加G0/G1期細胞的比例，抑制細胞增殖，并呈現(xiàn)出劑量依賴性(Fig 2C)。

2.2槲皮素抑制INF-γ誘導(dǎo)的犬尿氨酸的生成HeLa細胞等腫瘤細胞在促炎因子(如IFN-γ)的誘導(dǎo)下，可表達大量內(nèi)源性的IDO，因而在細胞培養(yǎng)上清中可檢測到犬尿氨酸含量的變化。值得注意的是，在HeLa細胞中IFN-γ只能誘導(dǎo)IDO1的表達，而不能誘導(dǎo)IDO2或色氨酸-2,3-雙加氧酶(tryptophan 2,3-dioxygenaes，TDO)的表達。在HeLa細胞中加入IFN-γ和不同濃度的槲皮素，48 h后收集細胞培養(yǎng)上清，經(jīng)檢測，槲皮素能夠明顯抑制IFN-γ誘導(dǎo)的犬尿氨酸生成(Fig 3)。

Fig 3 Effect of quercetin on kynurenine production

Quercetin potently inhibited kynurenine production in IFN-γ treated HeLa cells.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsIFN-γ treatment group without quercetin

2.3槲皮素抑制IDO1的體外酶催化活性為了驗證槲皮素是否抑制人IDO1蛋白的酶活性，首先在293T細胞中表達了IDO1蛋白，用Ni柱純化得到His-IDO1蛋白，并進行體外酶催化活性實驗(Fig 4A、4B)。如Fig 4C、4D所示，加入IDO1蛋白的反應(yīng)體系中犬尿氨酸(保留時間為6.8 min)的含量明顯增加，底物色氨酸(保留時間為16.2 min)的含量相應(yīng)減少，而加入1 μmol·L-1的槲皮素的樣品中，犬尿氨酸的生成受到明顯抑制，體系中還存在大量的底物色氨酸未發(fā)生反應(yīng)，為排除蛋白和體系反應(yīng)緩沖液的影響，我們對蛋白空白和體系空白也平行地進行了HPLC檢測。該結(jié)果表明，槲皮素抑制IDO1的體外酶催化活性，導(dǎo)致色氨酸代謝受阻以及腫瘤細胞的增殖抑制。

2.4槲皮素不影響IDO1的表達為了進一步確定槲皮素抑制HeLa細胞增殖與IDO1的酶催化活性有關(guān)，本研究檢測槲皮素處理對IDO1表達的影響。如Fig 5所示，人宮頸癌HeLa細胞與正常人宮頸上皮永生化細胞相比，其IDO1的mRNA水平以及蛋白表達明顯升高，這與已報道的結(jié)果相一致。多種腫瘤細胞高表達IDO1，從而異常代謝色氨酸，導(dǎo)致色氨酸的代謝產(chǎn)物犬尿氨酸大量堆積，從而促進腫瘤細胞的生成和遷移。另外，加入不同濃度的槲皮素(10、30 μmol·L-1)處理HeLa細胞24 h以后，其IDO1的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達均無明顯變化，證明槲皮素并不影響IDO1的表達。

2.5外源性添加犬尿氨酸能夠逆轉(zhuǎn)槲皮素引起的增殖抑制犬尿氨酸與腫瘤的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)，為了進一步證明槲皮素抑制HeLa細胞的增殖與色氨酸代謝受阻有關(guān)，我們用槲皮素處理細胞的同時，外源性添加不同濃度的犬尿氨酸，觀察細胞的增殖情況。如Fig 6所示，外源性添加犬尿氨酸能夠明顯逆轉(zhuǎn)槲皮素引起的增殖抑制，一定程度上抵消了槲皮素的抗腫瘤作用。

3 討論

色氨酸是人體必需氨基酸，色氨酸攝入不足或者代謝異?？蓪?dǎo)致疾病的發(fā)生。另據(jù)報道，色氨酸代謝在腫瘤細胞中異?；钴S，這與腫瘤的免疫逃逸密切相關(guān)。色氨酸在腫瘤細胞中主要通過IDO進行代謝，IDO可催化色氨酸降解生成犬尿氨酸，犬尿氨酸可以與芳香族化合物受體AHR結(jié)合，激活A(yù)HR通路，從而促進腫瘤細胞生長和遷移。這也可能是槲皮素抑制HeLa細胞增殖的更深入的分子機制，我們還在做進一步的研究。

IDO在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演了重要的角色。IDO在人類不同腫瘤中的表達均有所升高，如卵巢癌、肺癌、乳腺癌等，且IDO與腫瘤的預(yù)后也密切相關(guān)[12]。IDO不僅可催化色氨酸產(chǎn)生大量的犬尿氨酸，還可通過抑制抗腫瘤免疫反應(yīng)，影響腫瘤的生長。臨床試驗證明，IDO的小分子抑制劑治療能夠恢復(fù)機體對腫瘤的排斥反應(yīng)，而且可增強化療藥物的抗腫瘤效果。本研究表明，槲皮素對IDO的表達無影響，但具有明顯抑制IDO酶活性的作用。

Fig 4 Expression and catalytic activity of IDO1 in vitro

A, B: The expression and purification of IDO1 protein; C: Determination ofL-tryptophan andL-kynurenine by using HPLC after treatment with or without quercetin; D: Quantitative values from integrated peak area of HPLC.**P<0.01vsgroup treated without quercetin

Fig 5 Effect of quercetin on IDO1 mRNA level(A) and protein expression (B) in HeLa cells

**P<0.01vsH8 cells group

槲皮素是一種多羥基黃酮類化合物，許多中草藥中都含有槲皮素，其具有多種生物學(xué)活性，如抗腫瘤、抗氧化、抗炎、保護心血管系統(tǒng)等[13-14]。槲皮素抗腫瘤機制復(fù)雜，如槲皮素可引起腫瘤細胞的凋亡、抑制血管生成、促進腫瘤細胞自噬等。本研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素可能通過抑制IDO1的酶催化活性，從而影響細胞色氨酸的代謝，這也可能是槲皮素發(fā)揮抑制HeLa細胞增殖的作用機制之一。天然的小分子化合物是寶貴的資源，本文為槲皮素抗腫瘤提供了又一新的理論依據(jù)，同時也為免疫檢查點IDO抑制劑的篩選開拓了新的思路。

Fig 6 Addition of kynurenine reverses inhibitionof cell proliferation induced by quercetin

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsquercetin (10 μmol·L-1) treatment group without kynurenine addition;△P<0.05vsquercetin (30 μmol·L-1) treatment group without kynurenine addition

[1] Opitz C A, Litzenburger U M, Sahm F, et al. An endogenous tumour-promoting ligand of the human aryl hydrocarbon receptor[J].Nature, 2011,478(7368):197-203.

[2] Sugimoto H, Oda S, Otsuki T, et al. Crystal structure of human indoleamine 2,3-dioxygenase: catalytic mechanism of O2 incorporation by a heme-containing dioxygenase[J].ProcNatlAcadSciUSA, 2006,103(8):2611-6.

[3] Dai W, Gupta S L. Molecular cloning, sequencing and expression of human interferon-gamma-inducible indoleamine 2,3-dioxygenase cDNA[J].BiochemBiophysResCommun, 1990,168(1):1-8.

[4] Mellor A L, Munn D H. IDO expression by dendritic cells: tolerance and tryptophan catabolism[J].NatRevImmunol, 2004,4(10): 762-74.

[5] Metz R, Rust S, Duhadaway J B, et al. IDO inhibits a tryptophan sufficiency signal that stimulates mTOR: a novel IDO effector pathway targeted by D-1-methyl-tryptophan[J].Oncoimmunology, 2012,1(9):1460-8.

[6] Seegers N, van Doornmalen A M, Uitdehaag J C, et al. High-throughput fluorescence-based screening assays for tryptophan-catabolizing enzymes[J].JBiomolScreen, 2014,19(9):1266-74.

[7] Beatty G L, O’Dwyer P J, Clark J, et al. First-in-human phase I study of the oral inhibitor of indoleamine 2,3-dioxygenase-1 epacadostat (INCB024360) in patients with advanced solid malignancies[J].ClinCancerRes, 2017,23(13):3269-76.

[8] Zheng Y Z, Deng G, Liang Q, et al. Antioxidant activity of quercetin and its glucosides from propolis: a theoretical study[J].SciRep, 2017,7(1):7543.

[9] 孫 涓, 余世春. 槲皮素的研究進展[J]. 現(xiàn)代中藥研究與實踐, 2011,25(3):85-8.

[9] Sun J, Yu S C. Research progress of quercetin[J].ResPractChinMed, 2011,25(3):85-8.

[10] 王艷芳, 王新華, 朱宇同. 槲皮素藥理作用研究進展[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā), 2003,15(2):171-3.

[10] Wang Y F, Wang X H, Zhu Y T. Advances in pharmacological effects of quercetin[J].NatProdResDev, 2003,15(2):171-3.

[11] Yamamoto R, Yamamoto Y, Imai S, et al. Effects of various phytochemicals on indoleamine 2,3-dioxygenase 1 activity: galanal is a novel, competitive inhibitor of the enzyme[J].PLoSOne, 2014,9(2):e88789.

[12] Smith C, Chang M Y, Parker K H, et al. IDO is a nodal pathogenic driver of lung cancer and metastasis development[J].CancerDiscov, 2012,2(8):722-35.

[13] 劉紅亮, 胡 磊, 王靖凱, 等. 槲皮素對H2O2損傷PC12細胞的保護效果與機制[J]. 中國藥理學(xué)通報, 2014,30(3):373-7.

[13] Liu H L, Hu L, Wang J K, et al. Protective effect of quercetin on the oxidative damage induced by hydrogen peroxide and mechanism in PC12 cells[J].ChinPharmacolBull, 2014,30(3):373-7.

[14] 施劍明, 殷嫦嫦, 孫維君, 等. 槲皮素聯(lián)合順鉑對人骨肉瘤MG-63細胞增殖及凋亡的影響[J]. 中國藥理學(xué)通報, 2014,30(10):1361-6.

[14] Shi J M, Yin C C, Sun W J, et al. Effect of quercetin combined with cisplatin on proliferation and apoptosis of human osteosarcoma cell line MG-63[J].ChinPharmacolBull,2014,30(10):1361-6.