5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態(tài)性與腦梗死患者頸動(dòng)脈粥樣硬化的相關(guān)性研究

周浩，魏守超，趙興軍，劉芳，劉志輝

動(dòng)脈粥樣硬化是缺血性血管事件的高危因素，其所致動(dòng)脈管腔狹窄及斑塊脫落所致的血流動(dòng)力學(xué)異?？墒鼓X組織供血區(qū)低灌注進(jìn)而缺血缺氧壞死[1]。以往研究顯示，高同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）血癥與5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶（5，10-methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR）基因677位上堿基C突變?yōu)閴A基T有關(guān)。Hcy代謝相關(guān)酶MTHFR基因突變可通過升高Hcy導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生[2-3]。本研究旨在探究MTHFR基因多態(tài)性與前循環(huán)腦梗死患者頸動(dòng)脈動(dòng)脈粥樣硬化斑塊及其穩(wěn)定性的相關(guān)性。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 收集濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科2015年6月-2016年6月住院的新發(fā)前循環(huán)腦梗死患者，選擇同期無腦梗死的門診體檢者作為對(duì)照組。本研究經(jīng)過濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

入組標(biāo)準(zhǔn)：①新發(fā)前循環(huán)腦梗死，發(fā)病2周內(nèi)，腦梗死符合《中國急性缺血性卒中診治指南（2014版）》診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]；②根據(jù)急性卒中治療低分子肝素試驗(yàn)（Trial of Org 10 172 in Acute Stroke Treatment，TOAST）分型[5]為大動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死；③年齡＞18歲；④完成頸部血管超聲檢查；⑤患者及家屬知情同意。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①慢性胃腸道疾病、肝腎功能不全、甲狀腺疾病、惡性貧血、腫瘤、補(bǔ)充葉酸等對(duì)血漿中Hcy水平有影響的因素；②資料不全、中途退出、拒絕參加的患者。

1.2 分組及比較方法 比較腦梗死組與對(duì)照組的一般資料、血管危險(xiǎn)因素、MTHFRC677T基因型及基因頻率分布；將腦梗死組按照頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊性質(zhì)分為穩(wěn)定斑塊組和不穩(wěn)定斑塊組，比較兩組MTHFRC677T基因型及基因頻率分布。進(jìn)一步分析腦梗死組中MTHFRC677T基因多態(tài)性與頸動(dòng)脈狹窄程度的相關(guān)性。

1.3 一般資料收集 記錄所有研究對(duì)象的性別、年齡、高血壓、糖尿病、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病病史。所有入組者清晨空腹取肘靜脈血，采用Olympus 87全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血漿Hcy水平和血脂水平。Hcy≥15 μmol/L，為高Hcy血癥。高脂血癥各項(xiàng)指標(biāo)的定義為[6]：總膽固醇＞5.7 mmol/L、甘油三酯＞1.7 mmol/L、低密度脂蛋白膽固醇＞3.3 mmol/L；滿足其中一條即可診斷為高脂血癥。

1.4 雙側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈顱外段超聲檢測(cè) 采用西門子2000（探頭型號(hào)：9L4Multi-D，頻率：9MHz）血管超聲多普勒儀器，分別觀察入組者雙側(cè)頸總動(dòng)脈起始部、主干及分叉部血管內(nèi)膜有無動(dòng)脈粥樣硬化斑塊及斑塊性質(zhì)。

頸內(nèi)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊及性質(zhì)的確認(rèn)[7]：在頸動(dòng)脈竇以下1 cm處測(cè)量?jī)?nèi)膜中膜厚度。按照內(nèi)膜中膜厚度＞1.3 mm判斷為頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成。根據(jù)斑塊回聲強(qiáng)度分為：Ⅰ級(jí)低回聲脂質(zhì)型斑塊，Ⅱ級(jí)等回聲纖維型斑塊，Ⅲ級(jí)強(qiáng)回聲或伴聲影的鈣化型斑塊，Ⅳ級(jí)回聲強(qiáng)弱不均的潰瘍型混合斑塊。Ⅰ、Ⅳ級(jí)為不穩(wěn)定斑塊組；Ⅱ、Ⅲ級(jí)為穩(wěn)定斑塊組。有兩處或兩處以上斑塊且性質(zhì)不同以病變程度較重處為準(zhǔn)。

頸動(dòng)脈狹窄程度的分型[8]：①輕度狹窄，狹窄率＜50%，灰階圖像顯示局部斑塊形成，管徑相對(duì)減小，血流無明顯變化。②中度狹窄，狹窄率為50%～69%，狹窄段血流出現(xiàn)加速度，狹窄遠(yuǎn)段病理性渦流形成。③重度狹窄，狹窄率為70%～99%，狹窄段流速進(jìn)一步升高，狹窄近段流速相對(duì)減低，遠(yuǎn)段出現(xiàn)渦流和湍流混雜的血流信號(hào)。④血管閉塞，血流信號(hào)消失，無血流通過。若存在兩處及兩處以上的狹窄，以程度重者為準(zhǔn)。

1.5MTHFRC677T基因多態(tài)性檢測(cè) 樣本脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）的制備：采集靜脈血1 ml，加至抗凝管中，用血液基因組DNA提取試劑盒提取和純化DNA。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增：將MTHFR擴(kuò)增液分裝到0.2 ml薄壁管中做好標(biāo)記，根據(jù)要檢測(cè)的樣本數(shù)，選取等量的擴(kuò)增管，在各擴(kuò)增管中分別加入1.0 μl的反應(yīng)液[（Thermus Aquaticus enzyme，Taq）酶、尿嘧啶-N-糖基化（uracil-N-glycosylase，UNG）酶]；在各擴(kuò)增管中加入2 μl提取好的樣品DNA溶液，混勻。然后將各管放入PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增后產(chǎn)物在2～8℃保存。

雜交顯色和結(jié)果分析：將MTHFR基因芯片放入雜交儀片架中，吸取190 μl雜交緩沖液，加入10 μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，混勻制成雜交反應(yīng)液，加入試管中，放入雜交儀運(yùn)行雜交程序；反應(yīng)結(jié)束后，取出芯片，將芯片放入生物芯片識(shí)讀儀中用基因芯片圖像分析軟件進(jìn)行圖像掃描和數(shù)據(jù)分析。

基因亞型的判斷：MTHFR3種基因型：677CC，677CT和677TT。其中677CC為MTHFR酶222位丙氨酸純合子，酶活性正常；677CT為MTHFR酶222位丙氨酸/纈氨酸雜合子，酶活性居中；677TT為MTHFR酶222位纈氨酸純合子，與677CC酶活性相比降低50%～60%。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料符合正態(tài)分布，用表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料用率表示，兩組間比較用χ2檢驗(yàn)。MTHFR基因多態(tài)性與頸動(dòng)脈狹窄程度的相關(guān)性用Spearman等級(jí)相關(guān)檢驗(yàn)。腦梗死患者多因素分析采用Logistic回歸模型，以頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊為因變量，以性別、年齡、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病、糖尿病、高血壓病、MTHFR基因C677T多態(tài)性為自變量，計(jì)算自變量的比值比（odds ratio，OR）和95%可信區(qū)間（confidence interval，CI）。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 腦梗死組150例，其中男85例，女65例，平均（63.93±7.56）歲。對(duì)照組100例，其中男55例，女45例，平均（64.63±7.16）歲。腦梗死組與對(duì)照組性別、年齡、吸煙、飲酒、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病、糖尿病病史等方面均無顯著性差異，腦梗死組的高Hcy血癥、高血壓、高脂血癥發(fā)病率顯著高于對(duì)照組（表1）。

表1 兩組一般危險(xiǎn)因素比較

2.2 腦梗死組與對(duì)照組MTHFRC677T基因型及基因頻率分布 腦梗死組MTHFRC677T突變（TT）基因型和T等位基因頻率均顯著高于對(duì)照組（分別χ2=22.067，P＜0.001；χ2=6.907，P=0.009）（表2）。

表2 腦梗死組與對(duì)照組基因多態(tài)性比較

2.3 腦梗死組中MTHFRC677T基因多態(tài)性與頸動(dòng)脈狹窄程度的相關(guān)性 腦梗死組CC基因型30例，其中頸動(dòng)脈無狹窄16例（53.3%），輕度狹窄9例（30.0%），中重度狹窄5例（16.7%）；CT基因型48例，其中頸動(dòng)脈無狹窄9例（18.8%），輕度狹窄16例（33.3%），中重度狹窄23例（47.9%）；TT基因型組72例，其中無狹窄10例（13.9%），輕度狹窄24例（33.3%），中重度狹窄38例（52.8%）。腦梗死患者M(jìn)THFR C677TC→T基因突變與頸動(dòng)脈狹窄程度呈正相關(guān)（r=0.353，P＜0.001）。

2.4 腦梗死組不穩(wěn)定斑塊組與穩(wěn)定斑塊組MTHFRC677T基因型及等位基因頻率分布 腦梗死患者中不穩(wěn)定斑塊組71例，穩(wěn)定斑塊組44例，不穩(wěn)定斑塊組MTHFRC677T突變（TT）基因型及T等位基因頻率均顯著高于穩(wěn)定斑塊組（分別是χ2=14.587，P＜0.001；χ2=6.978，P=0.008）（表3）。

表3 腦梗死患者穩(wěn)定斑塊組與不穩(wěn)定斑塊組間MTHFR C677T基因多態(tài)性比較

2.5 腦梗死患者頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成危險(xiǎn)因素多因素分析 將腦梗死患者頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成為因變量，性別、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病、MTHFR基因C677T多態(tài)性、高脂血癥和高Hcy血癥等腦梗死危險(xiǎn)因素納入Logistic回歸方程。結(jié)果顯示：性別、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病、MTHFR基因C677T多態(tài)性、高脂血癥和高Hcy血癥均是頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成的危險(xiǎn)因素。以C/C基因型為對(duì)照，C/T（P=0.001）、T/T（P=0.009）基因型均增加頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成的機(jī)會(huì)（表4）。

3 討論

既往研究發(fā)現(xiàn)MTHFR是Hcy代謝的關(guān)鍵酶之一，其存在三種基因型，分別是677CC（正常基因型），677TT（純合子突變基因型）和677CT（雜合子突變基因型）。編碼此酶的基因突變是造成Hcy水平增高及增加動(dòng)脈粥樣硬化和斑塊不穩(wěn)定性的高危因素[9]。MTHFR基因突變可導(dǎo)致MTHFR活性明顯下降，引起Hcy升高[10]。Hcy可損傷內(nèi)皮細(xì)胞、促進(jìn)平滑肌細(xì)胞的增殖、改變血液系統(tǒng)的抗凝狀態(tài)及血小板功能，參與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過程[11-13]。

目前，MTHFRC677T基因多態(tài)性是否與頸動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)仍存在著爭(zhēng)議。有研究發(fā)現(xiàn)，MTHFRC677T等位基因在動(dòng)脈內(nèi)彈力層斷裂中起一定作用，后者可使平滑肌細(xì)胞遷移到內(nèi)膜中，是早期動(dòng)脈粥樣硬化性器官損害發(fā)生發(fā)展的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[14]。但也有研究者認(rèn)為MTHFRC677T基因突變雖然可以引起Hcy水平升高，但與動(dòng)脈粥樣硬化并無顯著相關(guān)性[15]。

表4 頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成相關(guān)危險(xiǎn)因素分析

在本研究中，前循環(huán)大動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死患者M(jìn)THFRC677T突變（TT）基因型和T等位基因頻率均顯著高于對(duì)照組，提示MTHFR的T等位基因頻率可能是腦梗死的危險(xiǎn)因素。進(jìn)一步分析顯示腦梗死患者M(jìn)THFRC677TC→T基因突變與頸動(dòng)脈狹窄程度正相關(guān)，表明MTHFR的T等位基因頻率與腦梗死患者頸動(dòng)脈狹窄程度有關(guān)，可能是腦梗死患者頸動(dòng)脈狹窄的危險(xiǎn)因素。劉斌等研究顯示[16]，腦梗死組MTHFRC677T突變（TT）基因型及T等位基因頻率顯著高于對(duì)照組，此外，MTHFR的T等位基因頻率與腦梗死患者頸動(dòng)脈狹窄及其程度有關(guān)，與本文研究結(jié)果一致。

頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的性質(zhì)與腦梗死的發(fā)生密切相關(guān)。有研究顯示，導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化斑塊不穩(wěn)定的內(nèi)因主要是由于纖維帽厚度、偏心脂質(zhì)核心大小和堅(jiān)固性，易于破裂的斑塊與纖維帽的細(xì)胞外基質(zhì)膠原的積累和彈性纖維成分的減少[17-19]。本研究顯示，腦梗死組中不穩(wěn)定斑塊組MTHFRC677T突變（TT）基因型及T等位基因頻率高于穩(wěn)定斑塊組，表明MTHFRC677T突變（TT）基因型及T等位基因頻率是腦梗死患者頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊不穩(wěn)定性的高危因素。

以往研究發(fā)現(xiàn)[20-21]，補(bǔ)充葉酸可能減輕Hcy對(duì)血管的損害，本研究未分析葉酸對(duì)患者Hcy水平及頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的影響，后續(xù)研究需要完善相關(guān)數(shù)據(jù)。本研究以超聲對(duì)動(dòng)脈狹窄進(jìn)行判斷，其準(zhǔn)確性低于血管影像學(xué)檢查，而且操作者之間的不一致性也很難避免；另外，本研究中腦梗死組不是連續(xù)入組，可能會(huì)對(duì)結(jié)果造成一定的偏倚。

1 趙康仁，任乃勇，張渭芳，等.彩色多普勒超聲檢測(cè)頸動(dòng)脈粥樣硬化與腦梗死的相關(guān)研究[J].臨床醫(yī)學(xué)工程，2013，20：129-131.

2 張俊，郭富強(qiáng).高同型半胱氨酸血癥與缺血性腦卒中的研究進(jìn)展[J].實(shí)用醫(yī)院臨床雜志，2013，10：151-154.

3 梅鐵芳，李長彬，呂首旭，等.亞甲基四氫葉酸基因多態(tài)性與腦梗死[J].中華內(nèi)科雜志，2002，41：625-629.

4 中華醫(yī)學(xué)會(huì)神經(jīng)病學(xué)分會(huì)，中華醫(yī)學(xué)會(huì)神經(jīng)病學(xué)分會(huì)腦血管病學(xué)組.中國急性缺血性腦卒中診治指南2014[J].中華神經(jīng)科雜志，2015，48：246-257.

5 甄志剛，汪立燕，王晉朝，等.急性腦梗死TOAST分型的相關(guān)研究進(jìn)展[J].實(shí)用心腦肺血管病雜志，2011，19：1433-1434.

6 周萍，魏群.老年高血壓患者頸動(dòng)脈粥樣硬化與血清同型半胱氨酸、脂蛋白(a)的關(guān)系[J].南昌大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2013，53：35-41.

7 潘琦，郭立新，初明峰，等.糖尿病患者同型半胱氨酸及其代謝相關(guān)酶基因多態(tài)性與頸動(dòng)脈內(nèi)膜-中膜厚度的關(guān)系[J].中國動(dòng)脈硬化雜志，2005，13：195-198.

8 劉斌，劉昊，伊紅麗，等.頸動(dòng)脈顱外段狹窄及其程度與腦梗死病變部位的關(guān)系[J].中國動(dòng)脈硬化雜志，2005，13：507-508.

9 沈媛，余華峰，陸伯華，等.腦梗死患者同型半胱氨酸、5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態(tài)性與頸動(dòng)脈粥樣硬化的相關(guān)性[J].臨床薈萃，2011，26：1494-1496.

10 呂海宏，湯旭磊.同型半胱氨酸體內(nèi)代謝及調(diào)節(jié)的研究進(jìn)展[J].當(dāng)代醫(yī)學(xué)，2015，21：9-14.

11 陳磊，常榮.亞甲基四氫葉酸還原酶C677T基因多態(tài)性的研究進(jìn)展[J].中國循證心血管醫(yī)學(xué)雜志，2016，8：113-115.

12 施洪，劉輝強(qiáng)，郭潤達(dá).同型半胱氨酸水平與頸動(dòng)脈粥樣硬化程度斑塊穩(wěn)定性的關(guān)系[J].中國實(shí)用神經(jīng)疾病雜志，2013，16：52-53.

13 陳路明，王若丹，帥杰.血中同型半胱氨酸和亞甲基四氫葉酸還原酶C677T基因多態(tài)性與腦血管狹窄的關(guān)系[J].中國腦血管病雜志，2013，10：119-124.

14 Eaden J，Mayberry J.Guidelines for screening surveillance of asymptomatic colorectal cancer in patients with inflammatoroy bowel disease[J].Gut，2002，51：10-12.

15 Fernando S，Velayo S，Edward V.Predictive and protective factors associated with colorectal cancer in ulcerative colitis：a case-control study[J].Gastroenterology，2006，130：1941-1949.

16 劉斌，田冉，高端，等.同型半胱氨酸代謝酶MTHFR、CBS、MS基因多態(tài)性與腦梗死患者頸動(dòng)脈狹窄的相關(guān)性[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2011，21：4103-4108.

17 Linnebank M，Moskau S，Semmler A，et al.A possible genetic link between MTHFR genotype and smoking behavior[J].PLoS One，2012，7：e53322.

18 劉立梅，張曉紅，劉江濤.頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊與腦梗死的相關(guān)性分析[J].中國老年學(xué)雜志，2009，29：2101-2102.

19 王鵬，呂衛(wèi)華，劉和錦，等.老年腦梗死患者頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性與紅細(xì)胞分布寬度的關(guān)系[J].中華老年心腦血管病雜志，2013，15：488-491.

20 陳滿清，陳景開，周遼軍，等.葉酸對(duì)同型半胱氨酸致大鼠血管內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)性損傷的保護(hù)作用[J].中國微循環(huán)，2004，8：160-161，169.

21 Hotoleanu C，Chouky E.Hyperhomocysteinemia and methylenetetrahydrofolate reductase polymorphism in a patient with coronary artery disease and repetitive miscarriages[J].Rom J Intern Med，2012，50：313-316.