UPLC—MS/MS同時測定銀丹心腦通軟膠囊中7種活性成分及藥代動力學研究

貢磊磊+原會俊+王嵐+殷小杰+許海玉+梁日欣+楊洪軍

[摘要] 該文采用超高效液相色譜串聯(lián)質譜（UPLC-MS/MS），建立大鼠血漿中槲皮素（QCT）、山柰酚（KMF）、異鼠李素（ISR）、銀杏內酯A（GA）、銀杏內酯B（GB）、銀杏內酯C（GC）、白果內酯（BB）7種成分的分析方法。同時，探討單次灌胃給藥銀丹心腦通軟膠囊后上述7種成分在大鼠體內的藥代動力學特征。方法學考察結果表明，7種化合物線性關系良好（r≥0.997 1），日內、日間精密度和準確度的RSD均小于11%，基質效應和回收率分別為93.28%～103.6%和72.43%～95.77%，樣品室溫放置6，12 h，-20 ℃反復凍存和-20 ℃長期凍存后基本穩(wěn)定，其RSD均在11%以下，方法學考察符合生物樣品分析要求。大鼠灌胃銀丹心腦通軟膠囊后，上述7種成分的血漿藥代動力學參數(shù)如下： Cmax （45.02±11.28），（49.90±13.82），（27.85±8.38），（76.31±18.19），（76.54±15.43），（35.35±10.28），（48.70±12.34） μg·L-1；tmax （0.33±0.11），（0.50±0.23），（0.33±0.14），（0.75±0.29），（1.0±0.35），（1.5±0.23），（0.75±0.50） h；該研究建立的UPLC-MS/MS方法適于對大鼠口服銀丹心腦通軟膠囊后的槲皮素、山柰酚、異鼠李素、銀杏內酯A、銀杏內酯B、銀杏內酯C和白果內酯的藥代動力學研究。

[關鍵詞] 銀丹心腦通軟膠囊； 活性成分； 血漿； 藥代動力學

[Abstract] To estabish ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （UPLC-MS/MS） method for simultaneous determination of quercetin（QCT）， isorhamnetin（ISR）， kaempferol（KMF）， ginkgolide A（GA）， ginkgolide B（GB）， ginkgolide C（GC） and bilobalide（BB） in rat plasma and investigate the pharmacokinetic process of seven compounds after oral administration of Yindan Xinnaotong Ruanjiaonang， The results indicated that all calibrations curves showed good linearity （r≥0.997 1）. RSD of intra-day and inter-day precisions were all within 11%. The matrix effects and extraction recovery were in the range of 93.28%-103.6% and 72.43%-95.77% respectively. The peak concentration （Cmax） of QCT， ISR， KMF， GA， GB， GC and BB were （45.02±11.28）， （49.90±13.82）， （27.85±8.38）， （76.31±18.19）， （76.54±15.43）， （35.35±10.28）， （48.70±12.34） μg·L-1， respectively. The peak time （tmax） of seven constituents were （0.33±0.11）， （0.50±0.23）， （0.33±0.14）， （0.75±0.29）， （1.0±0.35）， （1.5±0.23）， （0.75±0.50） h， respectively. UPLC-MS/MS method established in this research was proved to be so rapid and sensitive that it can be applied to the pharmacokinetic study of seven bioactive constituents in Yindan Xinnaotong Ruanjiaonang.

[Key words] Yindan Xinnaotong Ruanjiaonang； bioactive compounds； rat plasma； pharmacokinetics

銀丹心腦通軟膠囊（YXC）是貴州百靈企業(yè)集團制藥股份有限公司在20世紀70年代根據(jù)苗族醫(yī)學“兩病兩綱”理論研制的復方制劑，由銀杏葉、丹參、絞股藍、燈盞細辛、大蒜、三七、山楂、天然冰片8味中藥組成，具有活血化瘀、行氣止痛、消食化滯等功效[1]，主要用于氣滯血瘀引起的胸痹，癥見胸悶、氣短、心悸等。目前，銀丹心腦通軟膠囊已被《中國藥典》2015年版收載，是目前臨床上廣為應用的大品種民族藥物。為了闡明銀丹心腦通軟膠囊科學內涵，課題組前期對銀丹心腦通軟膠囊化學成分、藥理作用及作用機制進行了較為系統(tǒng)和深入的研究。采用UPLC-MS/MS在銀丹心腦通軟膠囊中鑒別出70個化合物，其中黃酮類和銀杏內酯為其主要成分，且大部分黃酮類成分是以槲皮素、山柰酚和異鼠李素為苷元的苷類化合物[2]。藥效學研究表明，銀丹心腦通軟膠囊結合游泳運動后能夠改善動脈粥樣硬化大鼠的血液流變學指標，對動脈粥樣硬化有積極的預防作用，其作用機制可能與減少內皮細胞ICAM-1，PECAM-1的分泌，抑制細胞凋亡有關[4-6]。此外，銀丹心腦通軟膠囊、主要成分及主要成分配伍對離體心臟缺血再灌注損傷有一定的保護作用，其作用機制可能與抗氧化、減輕鈣超載、減少炎性因子釋放、調節(jié)Toll 樣受體相關[7-8]。endprint

中藥復方化學組成復雜，其所含的化學成分在生物活性、理化性質和含量等方面存在明顯差異，因此藥效作用可能主要來自其所含的的部分關鍵成分[9]。前期研究發(fā)現(xiàn)銀丹心腦通軟膠囊中黃酮類成分槲皮素、山柰酚、異鼠李素、銀杏內酯A、銀杏內酯B、銀杏內酯C、白果內酯含量較高，且這些成分具有抗炎、抗氧化、擴張血管、抑制血小板聚集、抗動脈粥樣硬化及對心肌缺血再灌注后的損傷具有保護作用[10-11]，這些成分的藥理作用及作用機制與課題組前期對銀丹心腦通軟膠囊研究相吻合，因此，認為這些成分可能為銀丹心腦通軟膠囊中的關鍵成分。研究表明，藥效活性較強且體內暴露顯著的成分可能為復方中的藥效物質基礎，為了闡明銀丹心腦通軟膠囊藥效物質基礎，本實驗建立高效、便捷、靈敏的UPLC-MS/MS方法，用于測定大鼠口服銀丹心腦通軟膠囊后7種主要活性成分的血藥濃度，并用于銀丹心腦通軟膠囊在大鼠體內的藥代動力學研究，為最終闡明銀丹心腦通軟膠囊藥效物質基礎、藥物安全性評價、臨床應用提供科學依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 6490 QQQ LC-MS分析系統(tǒng)，包括Agilent UPLC 1290液相色譜儀及Agilent 6490 QQQ三重四極桿質譜檢測器（美國Agilent公司），Mass-hunter工作站（美國Agilent公司）；QL-901渦旋混合器（江蘇海門市麒麟醫(yī)用儀器有限公司） ；Backman J30i離心機（美國Backman公司）；1/10萬分析天平（賽多利斯科學儀器有限公司）；NA-5L氮氣-空氣一體機（北京中興匯利科技有限公司）。

1.2 試劑與藥品

異鼠李素（批號110860-201109）、銀杏內酯A（批號110862-201310）、銀杏內酯B（批號110863-201209）、銀杏內酯C（批號110864-201307）、白果內酯（批號110865-201306）購于中國食品藥品檢定研究院；槲皮素（批號H-009-131012）、山柰酚（批號S-014-131118）購于成都瑞芬思生物科技有限公司；黃芩素（IS，批號CHB-H-041，成都克洛瑪生物科技有限公司）。所有對照品純度均大于98%。甲醇為色譜級（北京化工廠），乙腈為HPLC級（美國Fisher公司），乙酸乙酯（北京化工廠），98%甲酸（國藥集團化學試劑有限公司），β-葡萄糖醛酸酶、硫酸酯酶（美國Sigma-Aldrich公司）。銀丹心腦通軟膠囊（貴州百靈企業(yè)集團制藥股份有限公司，批號20140426）。

1.3 動物

SD大鼠，雄性，體質量（250±20） g，中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心提供，合格證號SCXK（軍）2012-0004。

2 方法

2.1 給藥與樣品采集

取健康SD大鼠6只，實驗前12 h禁食不禁水。灌胃銀丹心腦通軟膠囊（2.4 g·kg-1），分別于給藥后5，10，15，20，30，45，60，90，120，150，180，240，360，480，720，1 440 min經(jīng)大鼠眼球后靜脈叢采血約0.5 mL，置肝素化試管中，4 000 r·min-1離心10 min，分取上清，血漿置于-20 ℃冰箱中保存待測。

2.2 血漿樣品處理方法

取出樣品，37 ℃水浴解凍后，精密吸取血漿樣品200 μL，加入0.2 mol·L-1醋酸鹽緩沖液（pH 4.6）（0.2 mol·L-1醋酸鈉和醋酸以4.69∶5.10混合）120 μL，加入內標溶液100 μL，再加入980 U·mL-1葡萄糖醛酸苷水解酶和硫酸酯酶[以pH 4.6 0.2 mol·L-1醋酸鹽緩沖液稀釋葡萄糖醛酸苷水解酶和硫酸酯酶而得]80 μL，37 ℃振蕩水浴下水解30 min，加入甲醇600 μL終止反應。渦旋2 min后，13 000 r·min-1離心10 min，取上清液，50 ℃下氮氣吹干，加入甲醇200 μL溶解，15 000 r·min-1離心10 min，取上清液進樣分析。

2.3 對照品溶液及內標溶液的配制

精密稱取槲皮素（QCT），山柰酚（KMF），異鼠李素（ISR），銀杏內酯A（GA），銀杏內酯B（GB），銀杏內酯C（GC），白果內酯（BB）和黃芩素（IS）對照品適量置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻后，按一定比例配置成混合對照品儲備液。取黃芩素1 mg，加甲醇稀釋至質量濃度為100 μg·L-1內標液。

2.4 系列基質標準曲線樣品和質控樣品制備

混合對照品儲備液以75%甲醇溶液按一定比例稀釋，得QCT，ISR，KMF，GA，GB，GC，BB質量濃度為1，5，10，20，50，100 μg·L-1的系列混合對照品溶液。取空白血漿加入系列混合對照品溶液得系列基質標準曲線樣品。取200 μL血漿，加入混合對照品工作溶液低、中、高3個濃度的樣品，按2.2項處理得到含對照品的質控樣品，進UPLC-MS/MS分析。

2.5 色譜和質譜條件

色譜柱為Agilent SB-Aq C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為0.1%甲酸水（A）-乙腈（B）；梯度洗脫0～1.0 min，75%～10% A；1.0～3.5 min，10%～10% A；3.5～5.0 min，75%～10% A。流速0.3 mL·min-1，柱溫30 ℃。

APCI ESI離子源，MRM模式，碎裂電壓均為350 V，離子源條件為干燥氣溫度290 ℃；干燥氣體流速15 L·min-1；霧化氣壓力50 psi（1 psi=6.895 kPa）；鞘氣溫度350 ℃，流速12 L·min-1。在0～1 min，通過切換閥將色譜柱流出的組分切至waste閥，以免污染質量分析器。QCT，KMF，ISR，GA，GB，GC，BB和IS采用負離子掃描模式，定量分析離子對質譜條件見表1。各化合物的產物離子質譜圖見圖1。endprint

2.6 方法學考察

2.6.1 專屬性考察 取大鼠空白血漿、空白血漿加對照品和內標、給藥后血漿樣品（加內標），其余按2.2項下方法操作，獲得各供試品色譜圖，考察是否存在內源性干擾。

2.6.2 標準曲線與最低定量限 取系列濃度的基質標準曲線樣品，按2.2項下處理，建立UPLC-MS/MS方法分析后，以樣品濃度（X）為橫坐標，待測成分峰面積與內標峰面積的比值（Y）為縱坐標，以加權（權重1/X2）最小二乘法進行線性回歸計算，進行線性回歸，得到待測樣品標準曲線、線性范圍、相關系數(shù)和定量下限，實驗以S/N≥10作為定量標準。

2.6.3 準確度和精密度 按2.4項下方法配置低、中、高3個質量濃度的質控樣品，每個濃度取6份樣本，1 d內分別測定6份樣品，分別取1份樣品，連續(xù)測定3 d，計算待測樣品峰面積和內標峰面積的比值，代入當天的標準曲線求得實測濃度及實測濃度準確度，計算日內、日間精密度和準確度，以相對標準偏差（RSD）表示。

2.6.4 提取回收率和基質效應 按2.4項下方法配置低、中、高3個質量濃度的質控樣品，每個濃度樣本平行6份，按2.5項下質譜和色譜條件測定，得各成分峰面積A；取200 μL空白血漿按2.2項 下處理后，改用低、中、高3個濃度的混合對照品溶液復溶，每個濃度樣本平行6份，按2.5項下質譜和色譜條件測定，得各成分峰面積B；取相同濃度的混合對照品溶液，按2.5項下質譜和色譜條件測定，所得的色譜峰面積為C。提取回收率=A/B×100%，樣品的基質效應=B/C×100%。

2.6.5 穩(wěn)定性實驗 按2.4項下方法配置低、中、高3個質量濃度的質控樣品，分別在在室溫放置6，12 h，考察樣品的短期穩(wěn)定性；-20 ℃下反復凍融3次，考察樣品凍融的穩(wěn)定性；-20 ℃下冷藏4周考察樣品的長期穩(wěn)定性。計算結果以相對標準偏差（RSD）表示。經(jīng)測定在4種情況下得到的7種化合物的峰面積與零時間點的RSD均在15%以內，提示實驗條件下血漿樣品穩(wěn)定性良好。

2.6.6 大鼠口服銀丹心腦通軟膠囊后血漿中7種化合物藥代動力學研究 大鼠灌胃給予銀丹心腦通軟膠囊后，采用UPLC-MS/MS測定血漿中7種化合物的濃度，將大鼠血漿藥物濃度作為縱坐標（concentration）和時間作為橫坐標（time）作圖，獲得大鼠口服銀丹心腦通軟膠囊后7種主要成分的平均血藥濃度-時間曲線。

在DAS 2.1.1軟件中輸入所測得的7種化合物在各時間點的血藥濃度，采用統(tǒng)計矩方法擬合可獲得藥代動力學參數(shù)。以藥物半衰期（t1/2）、達峰濃度（Cmax）、達峰時間（tmax）和藥-時曲線下面積（area under the time-concentration curve，AUC）等參數(shù)表征該藥物的藥動學特征。

3 結果

3.1 專屬性考察

空白血漿、空白血漿加混合對照品以及給藥后所得血漿樣品色譜圖見圖2，QCT，ISR，KMF，GA，GB，GC，BB及內標物IS保留時間分別為2.433，2.582，2.557，2.497，2.494，2.323，2.454，2.611 min。經(jīng)考察7種待測化合物和內標化合物均不受內源性物質的干擾，方法特異性良好，適用于7種成分的含量測定。

3.2 標準曲線及線性范圍

以QCT，ISR，KMF，GA，GB，GC，BB濃度為橫坐標，以7種成分與內標峰面積比值為縱坐標，以加權最小二乘法進行線性回歸運算，得標準曲線、相關系 數(shù)、線性范圍及定量限見表2。結果表明，7種成分在1～100 μg·L-1線性關系良好，定量下限為1 μg·L-1（S/N≥10），表明該方法靈敏度較高，可用于7種成分的微量分析。血漿中7種化合物的標準曲線、相關系數(shù)、線性范圍及定量限見表2。

3.3 日內、日間精密度和準確度實驗

精密度和準確度結果見表3，結果表明，7種化合物的日內精密度RSD均小于9.9%，日間精密度RSD均小于11%，準確度為92.27%～107.5%，結果均符合生物樣品分析方法指導原則的要求。

3.4 基質效應及回收率試驗

基質效應及回收率結果見表4，結果表明，7種成分低、中、高3個濃度提取回收率在76.86%～95.77%，且RSD均小于11%，符合生物樣品分析要求。基質效應測定結果表明，7種成分低、中、高3個濃度機制效應為94.25%～103.3%，且RSD均小于12%，基質效應及回收率實驗表明該方法提取回收率較高，無內源性成分干擾，符合生物樣品的分析方法的要求。

3.5 穩(wěn)定性試驗

穩(wěn)定性實驗結果表明，7種質控樣品室溫放置6，12 h，-20 ℃反復凍存和-20 ℃長期凍存后基本穩(wěn)定，其RSD均在11%以下，符合生物樣品測定要求，見表5。

3.6 藥代動力學試驗

大鼠灌胃給予銀丹心腦通軟膠囊后，采用建立的UPLC-MS/MS方法測定各時間點血藥濃度，7種化合物在大鼠體內的平均藥-時曲線見圖3，血藥濃度數(shù)據(jù)采用DAS 2.1.1軟件進行計算，以藥物半衰 期（t1/2）、達峰濃度（Cmax）、達峰時間（tmax）和藥-時曲線下面積（area under the time-concentration curve，AUC）等參數(shù)表征該藥物的藥動學特征，見表6。結果顯示大鼠給藥后5 min在血中可以檢測到7種成分，從達峰時間來看，槲皮素、山柰酚和異鼠李素達峰時間較快，分別為0.33，0.5，0.33 h，其次為銀杏內酯A（0.75 h）、白果內酯（0.75 h）、銀杏內酯B（1.0 h）、銀杏內酯C（1.5 h）。從半衰期看，槲皮素、銀杏內酯C、白果內酯半衰期較短，分別為2.69，5.45，5.55 h，其次為銀杏內酯A（7.52 h）、銀杏內酯B（7.84 h）、異鼠李素（8.19 h）、山柰酚半衰期最常（10.48 h）。從體內暴露程度量來看，銀杏內酯B在大鼠血漿中AUC最大，說明銀杏內酯B具有較好的生物利用度。從平均血藥濃度-時間曲線可以看出，3種黃酮類成分存在明顯的雙峰現(xiàn)象。口服銀丹心腦通軟膠囊后，黃酮類成分達峰時間快，在體內滯留時間較長，消除較慢；而銀杏內酯類成分達峰時間較慢，半衰期較黃酮類時間短，體內滯留時間短，消除快。endprint

4 討論

銀丹心腦通軟膠囊口服后，體內的槲皮素、山柰酚和異鼠李素藥-時曲線存在明顯的雙峰，表明這3種成分在體內可能通過肝腸循環(huán)進行重吸收，這與文獻中報道的一致[12-13]，這將增加和維持銀丹心腦通軟膠囊3種成分在體內較高的血藥濃度，是藥物作用的持續(xù)時間延長。

黃酮類成分tmax均在0.5 h以內，說明銀丹心腦通軟膠囊中黃酮類成分能被迅速地吸收，這可能與其較大的脂溶性，易透過細胞膜有關。銀杏內酯類成分tmax均在0.75 h以上，在體內吸收較慢。槲皮素和銀杏內酯類成分MRT和t1/2均在10.58 h以內，說明單次給藥后，在體內消除較快，不易在體內產生殘留和蓄積。而山柰酚和異鼠李素MRT均超過13.91 h，在體內消除較慢，且兩種成分均出現(xiàn)雙峰，因此每日3次服用藥物有助于維持穩(wěn)態(tài)血藥濃度。血漿中7種成分依據(jù)藥代動力學參數(shù)Cmax的平均值排序為GB>GA>KMF>BB>QCT>GC>ISR；AUC0–t的平均值排序為GB>GA>QCT>KMF>BB>ISR>GC；t1/2的平均值排序為KMF>ISR>GB>GA>BB>GC>QCT。由此可見，GB的Cmax和AUC0–t最大，而t1/2相對較小，說明GB被吸收入血的量最多，并能被很快消除。研究表明GB是銀杏內酯類化合物中抑制血小板活化最強的一種，并且已經(jīng)被開發(fā)為銀杏內酯B注射液在臨床用于治療心腦血管疾病[14-15]。

綜上，本文建立了一種簡便、快速且靈敏度高的UPLC-MS/MS測定方法，樣品處理方法簡單，能同時檢測出銀丹心腦通軟膠囊中7種成分的含量，適用于銀丹心腦通軟膠囊的藥代動力學研究。通過藥代動力學研究，了解銀丹心腦通軟膠囊中7種主要成分在體內的暴露，有利于更精確地研究這些成分的藥效作用，并為闡明銀丹心腦通軟膠囊體內藥效物質基礎和安全合理用藥提供了科學依據(jù)。

[參考文獻]

[1] 胡穎軍， 張進朝， 王嵐，等. 銀丹心腦通軟膠囊對高脂血癥大鼠血脂和血管內皮分泌物質的影響 [J]. 中國實驗方劑學雜志， 2011， 17（21）：162.

[2] Gong L L， Xu H Y， Wang L， et al. Identification and evaluation of the chemical similarity of Yindan xinnaotong samples by ultra high performance liquid chromatography with quadrupole time-of-flight mass spectrometry fingerprinting [J]. J Sep Sci， 2016， 39（3）：611.

[3] 貢磊磊. 銀丹心腦通軟膠囊物質基礎及生物活性研究 [D]. 北京：中國中醫(yī)科學院， 2016.

[4] Cheng L， Pan G F， Zhang X D， et al. Yindanxinnaotong， a Chinese compound medicine， synergistically attenuates atherosclerosis progress [J]. Sci Rep， 2015， 5（12333）：12333.

[5] Wang J， Wang L， Yang H， et al. Prevention of atherosclerosis by Yindan Xinnaotong capsule combined with swimming in rats [J]. Bmc Complem Altern M， 2015， 15（1）：109.

[6] 王建露，王嵐，成龍，等. 銀丹心腦通軟膠囊與運動聯(lián)合應用對動脈粥樣硬化大鼠的防治作用研究 [J]. 中國中藥雜志，2014，39（13）：2547.

[7] Wang W， Wang L， Yang H， et al. Protective effects of Yindanxinnaotong capsule in a rat model of myocardial ischemia/reperfusion injury [J]. J Tradit Chin Med， 2014， 34（6）：699.

[8] 王萬丹， 王嵐， 成龍，等. 銀丹心腦通及主要成分配伍對心肌缺血再灌注損傷的保護作用 [J]. 中國中藥雜志， 2014， 39（9）：1690.

[9] 李川. 中藥多成分藥代動力學研究：思路與方法 [J]. 中國中藥雜志， 2017， 42（4）：607.

[10] Perez A， Gonzalez-Manzano S， Jimenez R， et al. The flavonoid quercetin induces acute vasodilator effects in healthy volunteers： Correlation with beta-glucuronidase activity[J]. Pharmacol Res， 2014， 89：11.

[11] Kong L， Luo C， Li X， et al. The anti-inflammatory effect of kaempferol on early atherosclerosis in high cholesterol fed rabbits [J]. Lipids Health Dis， 2013， 12（1）：115.

[12] Scholtyssek H， Damerau W， Wessel R I. Schimke， Antioxidative activity of ginkgolides against superoxide in an aprotic environment [J]. Chem Biol Interact，1997， 106：183.

[13] Gu J H， Ge J B， Li M， et al. Inhibition of NF-κB activation is associated with anti-inflammatory and anti-apoptotic effects of ginkgolide B in a mouse model of cerebral ischemia/reperfusion injury [J]. Eur J Pharm Sci， 2002，47：652.

[14] Maclennan K M， Darlington C L， Smith P F. The CNS effects of ginkgo biloba extracts and ginkgolide B[J]. Prog Neurobiol， 2002， 67（3）：235.

[15] 紀傳榮， 程麗. 銀杏內酯B注射液治療動脈粥樣硬化性血栓性腦梗死（瘀血阻絡證）的臨床研究[J]. 中西醫(yī)結合研究， 2015， 7（3）：120.

[責任編輯 呂冬梅]endprint