腦型瘧研究新進(jìn)展

李建良+李凱+郭媛+趙正+陳利娜+姜曉慧+李玉潔+圖雅+鄭曉俊

[摘要] 腦型瘧（cerebral malaria，CM）是惡性瘧原蟲感染所致神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，嚴(yán)重危及生命，CM死亡率高，生存的患者持續(xù)的腦損傷可表現(xiàn)為長期的認(rèn)知功能障礙。CM的主要病理學(xué)特征是感染瘧原蟲紅細(xì)胞（parasitised red blood cells，pRBC）在腦微血管中的滯留、腦實(shí)質(zhì)中的點(diǎn)狀、環(huán)狀出血，以及廣泛的腦內(nèi)皮細(xì)胞活化、局灶性內(nèi)皮細(xì)胞損傷和壞死等。但其發(fā)病機(jī)制至今尚不明確。目前研究認(rèn)為，腦型瘧的發(fā)病機(jī)制主要包括：pRBC黏附、炎癥反應(yīng)級聯(lián)、血管滲漏性損傷、腦部缺血缺氧等。研究表明，目前用作CM診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物有（C-X-C motif chemokine ligand 10，CXCL10）、（CXC chemokine ligand 4，CXCL4）、血管生成素（angiopoietin，Ang）等。該文梳理了近年來腦型瘧基礎(chǔ)及臨床研究、藥物研究的最新文獻(xiàn)，著重從細(xì)胞因子、免疫細(xì)胞、調(diào)控因子、相關(guān)生物標(biāo)志物等方面系統(tǒng)總結(jié)近3年腦型瘧炎癥及免疫機(jī)制相關(guān)研究進(jìn)展，為相關(guān)研究提供參考。

[關(guān)鍵詞] 腦型瘧； 機(jī)制； 炎癥； 免疫； 病理； 治療

[Abstract] Cerebral malaria （CM）， a severe neurological syndrome caused by Plasmodium falciparum infection， is a serious life-threatening disease with a high mortality. Survivors′ persistent brain injury is manifested as long-term neurocognitive disorders. The main neuropathological feature of CM is the sequestration of parasited red blood cells （pRBCs） in cerebral microvessels. Other neuropathological features of CM include petechial hemorrhage in the brain parenchyma， annular hemorrhage， extensive brain endothelial cell activation， and focal endothelial cell injury and necrosis. However， its pathogenesis is still not clear. Currently， some studies have suggested that the pathogenesis of cerebral malaria mainly include pRBC adhesion， inflammatory reaction cascade， vascular leakage damage and brain hypoxia. Studies have shown that the biomarkers currently used as diagnostic and prognostic markers for CM include C-X-C motif chemokine ligand 10 （CXCL10）， CXC chemokine ligand 4 （CXCL4）， angiopoietin （Ang）. In this paper， we systematically summarize the basic and clinical research for cerebral malaria in recent years and the latest literatures for drug studies， and focused on the advance of studies on cerebral malaria and its immunologic mechanism in the recent three years in the aspects of cytokines， immune cells， regulatory factors and biomarkers， so as to provide references for relevant studies.

[Key words] cerebral malaria； mechanism； inflammation； immune； pathology； therapy

瘧疾是嚴(yán)重威脅人類健康和生命安全的重大傳染病，在全世界108個(gè)國家和地區(qū)傳播流行，全球約半數(shù)人口受到瘧疾的威脅，為世界三大公共衛(wèi)生問題之一。2015年全球約有2.87億瘧疾新發(fā)病例，73.15萬人死于重癥瘧疾[1-2]。

腦型瘧（cerebral malaria，CM）是惡性瘧原蟲感染所致暴發(fā)性神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，也是惡性瘧最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，74%的腦型瘧病例發(fā)生在五歲以下非洲兒童，死亡率為15%～20%（WHO，World Malaria Report 2015）。腦型瘧臨床可出現(xiàn)輕偏癱、抽搐、共濟(jì)失調(diào)、昏迷及意識(shí)障礙、腦膜刺激征及至死亡，且幸存兒童中有10%～20%出現(xiàn)持續(xù)性神經(jīng)功能缺損、認(rèn)知功能障礙、行為障礙以及運(yùn)動(dòng)功能損傷[3]。盡管腦型瘧基礎(chǔ)研究已有數(shù)十年的歷史，但其作用機(jī)制并不明確，目前認(rèn)為腦型瘧病理改變可包括血腦屏障破壞、免疫細(xì)胞活化、血小板激活、一氧化氮（nitric oxide，NO）生物利用度降低、神經(jīng)系統(tǒng)炎癥等[4-5]，機(jī)械阻塞學(xué)說[6-7]、免疫病理學(xué)說[8-10]是較受公認(rèn)的兩大學(xué)說，兩者相互補(bǔ)充可較好的解釋腦型瘧發(fā)生發(fā)展全過程。endprint

近年來越來越多的證據(jù)表明，機(jī)體免疫過激所致促炎-抑炎反應(yīng)失衡是腦型瘧發(fā)生的首要原因。新近臨床研究進(jìn)一步證實(shí)，重度炎癥是兒童腦型瘧的重要特征[11]，除瘧原蟲局部滯留、血腦屏障破壞和以T細(xì)胞為代表的免疫細(xì)胞在腦內(nèi)浸潤活化等傳統(tǒng)認(rèn)識(shí)外，發(fā)現(xiàn)有視網(wǎng)膜病變并發(fā)癥的腦型瘧兒童血漿中髓過氧化物酶等嗜中性粒細(xì)胞活化產(chǎn)物高表達(dá)[12]，且患兒機(jī)體炎癥狀態(tài)可進(jìn)而影響鐵的吸收、利用[11]。在實(shí)驗(yàn)性腦瘧（experimental cerebral malaria，ECM）模型小鼠腦組織中干擾素（interferon-γ，IFN-γ）受體、淋巴毒素β受體（lymphotoxin-β）和可溶性凋亡相關(guān)因子配體（factor associated suicide ligend，sFAS-L）表達(dá)均顯著增加[13]，進(jìn)一步提示腦型瘧炎癥相關(guān)機(jī)制的復(fù)雜性。本文在既往研究基礎(chǔ)上，總結(jié)近3年腦型瘧發(fā)生炎癥及免疫機(jī)制的最新進(jìn)展，為相關(guān)研究提供參考。

1 細(xì)胞因子在腦型瘧發(fā)生中的作用

瘧原蟲感染早期，宿主主要通過活化天然免疫應(yīng)答抑制瘧原蟲的增殖和擴(kuò)散，巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞活化后釋放促炎細(xì)胞因子、趨化因子等，增強(qiáng)吞噬細(xì)胞對感染瘧原蟲的殺滅作用。可以說前炎癥因子的應(yīng)答水平?jīng)Q定了原蟲早期爆發(fā)性增殖是否能被更有效地控制。之后，在抗炎免疫介質(zhì)誘導(dǎo)下炎癥反應(yīng)下調(diào)，從而防止組織器官損害等不利影響。如上述保護(hù)性免疫應(yīng)答無法協(xié)調(diào)過渡，宿主和瘧原蟲衍生因子之間復(fù)雜相互作用介導(dǎo)的失控性免疫反應(yīng)和大量炎癥因子的釋放成為腦型瘧發(fā)生的重要原因。

有研究者分析了非洲達(dá)喀爾地區(qū)腦型瘧患者臨床研究中涉及的29種血清炎癥標(biāo)志物，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞因子表達(dá)譜變化與成人腦型瘧患者的臨床結(jié)局直接相關(guān)。腦型瘧患者血清促炎因子水平高于非腦型瘧瘧疾患者，抗炎細(xì)胞因子中除Th2抗炎細(xì)胞因子白細(xì)胞介素5（interleukin-1，IL-5）顯著降低外均無明顯變化。與腦型瘧幸存者相比，腦型瘧死亡病例嗜酸細(xì)胞活化趨化因子（eotaxin）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF-α）、白細(xì)胞介素1（interleukin-1，IL-1）、單核細(xì)胞趨化因子（monocyte chemoattractant protein1，MCP-1）4種促炎癥因子顯著增加。這提示失控性炎癥是非洲成年人腦瘧死亡的主要原因[14]。

Guha S K等發(fā)現(xiàn)，即使輕度瘧疾感染小鼠模型（pasmodium chabaudi adami）在寄生蟲血癥高峰期和感染15 d后大腦均可見促炎細(xì)胞因子譜變化，并可誘發(fā)神經(jīng)源性行為改變，同時(shí)伴隨著海馬小膠質(zhì)細(xì)胞激活和再分布，海馬神經(jīng)發(fā)生也出現(xiàn)了暫時(shí)但明確的受抑現(xiàn)象[15]。在伯氏瘧原蟲ANKA（Plasmodium berghei ANKA，PbA）感染C57BL/6小鼠建立的實(shí)驗(yàn)性腦型瘧經(jīng)典模型上，Khandare A V等觀察了PbA感染后3個(gè)不同階段免疫病理變化和負(fù)性免疫調(diào)節(jié)分子表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)PbA感染3 d后在腦組織中可檢測到感染瘧原蟲紅細(xì)胞，5 d后出現(xiàn)腦水腫和組織病理改變，7 d后腦內(nèi)不同區(qū)域可見出血點(diǎn)。小腦組織中免疫負(fù)性調(diào)控分子程序化細(xì)胞死亡- 1配體1（programmed cell death-1 ligand 1，PD-L1）、細(xì)胞毒性T細(xì)胞相關(guān)蛋白-4（cytotoxic T lymphocyte associate protein-4，CTLA-4）、淋巴細(xì)胞活化基因-3（lymphocyte activation gene-3，LAG-3）表達(dá)增加，海馬組織中CXC趨化因子配體-4（C-X-C motif chemokine ligand - 4，CXCL-4）表達(dá)降低是最早可觀察到的免疫學(xué)改變。感染5 d后腦組織各個(gè)部位TNF-α、CXC趨化因子配體10（C-X-C motif chemokine ligand 10，CXCL10）和巨噬細(xì)胞炎蛋白1β （macrophage inflammatory protein 1 beta，MIP-1β）均顯著增加，7 d后PD-L1，CTLA-4，PD-L1在不同腦區(qū)均表達(dá)上調(diào)。這些腦型瘧形成過程中腦組織免疫病理變化動(dòng)態(tài)檢測的數(shù)據(jù)，為其針對性干預(yù)提供依據(jù)[13]。

1.1 IL-1家族 大量文獻(xiàn)報(bào)道IL-1家族成員IL-33既可發(fā)揮核內(nèi)轉(zhuǎn)錄抑制因子作用，又可釋放到胞外具有促炎癥細(xì)胞因子的功能，在瘧原蟲感染過程中發(fā)揮著極其重要的作用。Palomo J等研究發(fā)現(xiàn)PbA感染致實(shí)驗(yàn)性腦型瘧模型腦內(nèi)皮細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞可表達(dá) IL-33，同時(shí)腦內(nèi)（cluster of differentiation 4 receptors positive，CD4+）CD4+和（cluster of differentiation 8 receptors positive，CD8+）CD8+ T細(xì)胞募集增加。與野生型小鼠比較，IL-33膜型（sulfotransferase 2，ST2）受體缺陷型小鼠可明顯延長小鼠生存期，血腦屏障完整性增強(qiáng)，微血管堵塞和出血等腦型瘧特有的神經(jīng)病理損傷減輕，大腦組織內(nèi)細(xì)胞間黏附分子-1（intercellularadhesionmolecule-1，ICAM-1）、CXCR3、淋巴毒素α （1ymphotoxin α，LT-α）明顯減少，而原蟲血癥和腦部瘧原蟲蓄積量并無明顯差異[16]，與之相應(yīng)，Reverchon F等也發(fā)現(xiàn)ST2敲除鼠不再出現(xiàn)早期空間記憶缺陷等認(rèn)知障礙和血腦屏障破壞，同時(shí)神經(jīng)炎癥也明顯減輕[17]，這些均提示IL-33/ST2信號通路在實(shí)驗(yàn)性腦瘧形成發(fā)展中可能具有重要作用。有研究顯示IL-33 參與瘧原蟲感染主要并發(fā)癥肺損傷的病理過程，瘧疾致休克患者支氣管IL-33表達(dá)明顯增加，且與CD68+ 單核細(xì)胞、彈性蛋白酶陽性中性粒細(xì)胞及相關(guān)肺組織病理變化呈正相關(guān)[18]。但I(xiàn)L-33在腦型瘧疾發(fā)生發(fā)展中的作用也有不同的報(bào)道，Besnard A G等研究發(fā)現(xiàn)，預(yù)防性給予IL-33對PbA誘導(dǎo)腦型瘧模型具有保護(hù)意義，IL-33 可誘導(dǎo)2型固有淋巴細(xì)胞 （type-2 innate lymphoid cells，ILC2）增殖，Th2 型細(xì)胞因子釋放增加，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化為M2表型，并誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞Tregs進(jìn)而抑制Th1反應(yīng)，但晚期給予 IL-33 對腦型瘧無明顯影響，提示IL-33在瘧原蟲感染早期主要發(fā)揮抗炎、免疫清除、組織修復(fù)及重建作用，但在感染晚期機(jī)體免疫調(diào)節(jié)作用失衡等復(fù)雜過程中，IL-33發(fā)揮的作用尚需進(jìn)一步深入研究。endprint

1.2 IL-10家族 在瘧原蟲感染期間，促炎和免疫反應(yīng)之間的平衡破壞可導(dǎo)致嚴(yán)重的瘧疾病理學(xué)損害。Wilson K D 等發(fā)現(xiàn)IL-10在瘧疾感染過程中的炎癥調(diào)節(jié)、神經(jīng)損傷保護(hù)和下游行為學(xué)改變中發(fā)揮不可或缺的作用。與野生型小鼠相比，感染PbA的IL-10基因敲除小鼠存活率顯著降低，出現(xiàn)嚴(yán)重的神經(jīng)損傷和行為學(xué)改變，腦內(nèi)血管IFN-γ+ T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞黏附數(shù)明顯增高，小膠質(zhì)細(xì)胞活化等神經(jīng)炎癥反應(yīng)明顯，但并未出現(xiàn)瘧原蟲腦內(nèi)蓄積現(xiàn)象[19]。IL-10細(xì)胞因子家族成員IL-22在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，研究證實(shí)IL-22基因敲除小鼠在PbA 感染早期即可導(dǎo)致腦瘧發(fā)生，可見T細(xì)胞IFNγ分泌增高、IL-17分泌減少，樹突狀細(xì)胞表達(dá)的共刺激配體CD86顯著上調(diào)，提示IL-22基因敲除小鼠的骨髓源樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)的CD8+ T細(xì)胞抗原特異性IFNγ 應(yīng)答增強(qiáng)[20]。

1.3 趨化因子家族 趨化因子在重要器官的募集是重癥瘧疾的重要因素之一，在腦型瘧致死兒童腦脊髓液中可見趨化因子高表達(dá)。CXCL4、CXCL10可作為惡性瘧原蟲介導(dǎo)的腦型瘧風(fēng)險(xiǎn)增加的生物標(biāo)志物[21]，CXCL10基因啟動(dòng)子多態(tài)性與男性對腦瘧疾的易感性有關(guān)[22]，CXCL10阻斷劑與抗瘧藥聯(lián)合用藥可大大降低實(shí)驗(yàn)性腦瘧的死亡率[23]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)CXCL10基因敲除小鼠寄生蟲血癥、腦寄生蟲蓄積率、白細(xì)胞浸潤率均高于野生型小鼠，對實(shí)驗(yàn)性腦瘧的敏感性增加，中性粒細(xì)胞和炎性單核細(xì)胞是此過程中CXCL10的主要細(xì)胞來源。提示瘧疾感染繼發(fā)炎癥反應(yīng)與靶器官高瘧原蟲蓄積間存在直接相關(guān)性[24]。

2 免疫細(xì)胞在腦型瘧發(fā)生中的作用

早期研究認(rèn)為腦型瘧的發(fā)生主要是感染瘧原蟲紅細(xì)胞導(dǎo)致腦微血管的機(jī)械性阻塞[6]。然而，近年來越來越多的證據(jù)支持瘧原蟲感染引發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)發(fā)揮更為關(guān)鍵的作用。瘧原蟲感染后在蟲體活性成分免疫誘導(dǎo)下，機(jī)體固有免疫和適應(yīng)性免疫相繼啟動(dòng)，腦微血管局部單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、樹突細(xì)胞、肥大細(xì)胞等異常沉積及活化，細(xì)胞因子、補(bǔ)體、免疫球蛋白等免疫活性物質(zhì)的產(chǎn)生及釋放，介導(dǎo)保護(hù)性免疫修復(fù)過程，而免疫過激介導(dǎo)的病理損傷最終可導(dǎo)致致命性腦型瘧的發(fā)生[25-26]。

2.1 樹突狀細(xì)胞 樹突狀細(xì)胞（dendriticcells，DCs）是功能最強(qiáng)大的專職抗原提呈細(xì)胞，是啟動(dòng)、監(jiān)控、調(diào)節(jié)宿主免疫應(yīng)答的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。接觸瘧原蟲蟲體組分后，DCs可遷移到二級淋巴器官激活T淋巴細(xì)胞啟動(dòng)免疫反應(yīng)。未被破壞的惡性瘧原蟲感染紅細(xì)胞表面可表達(dá)惡性瘧原蟲紅細(xì)胞膜蛋白1（P. falciparum erythrocytemembraneproteinl，PfEMPl），能與宿主DCs 表面的CD36 和血小板反應(yīng)蛋白相互作用從而抑制DCs成熟，未成熟DCs不能提呈抗原肽MHC（major histocompatibility complex）以供 T 細(xì)胞識(shí)別，這使得紅內(nèi)期 CD4+T細(xì)胞不能被有效活化。Piva L等認(rèn)為DC亞群Clec9A+DC缺失可完全阻斷實(shí)驗(yàn)性腦瘧發(fā)生，伴隨腦內(nèi)CD8+T細(xì)胞的急劇減少和活化程度顯著降低，腦中寄生蟲負(fù)荷也明顯減輕，表明Clec9A+DC參與介導(dǎo)實(shí)驗(yàn)性腦瘧的發(fā)生[27]。Keswani T等發(fā)現(xiàn)TGF-β（Transforming growth factor beta）拮抗可降低PbA感染實(shí)驗(yàn)性腦瘧小鼠CD11c + CD8 + DC的表達(dá)，加重寄生蟲血癥和免疫病理損傷的程度，拮抗IL-6可延緩減輕PbA感染介導(dǎo)免疫損傷，同時(shí)脾細(xì)胞中TGF-β、IL-10和轉(zhuǎn)錄因子T細(xì)胞活化核因子（nuclear factor of activated T cells，NFAT）、Foxp3、STAT-5、Smad-3 下調(diào)，IL-6、IL-23、IL-17、STAT-3表達(dá)上調(diào)。提示IL-6和TGF-β參與PbA感染期間DC、Treg、Th17細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用，可能在DCs亞型分化和Treg/Th17失衡中起關(guān)鍵作用[28]。在過繼轉(zhuǎn)移半免疫小鼠CD11c+細(xì)胞后，實(shí)驗(yàn)性腦型瘧小鼠脾臟CD11c+ DC百分比顯著增高，瘧原蟲增殖減慢，小鼠神經(jīng)病理學(xué)改變造成的死亡率降低，同時(shí)IgG1水平增高，表明半免疫小鼠的CD11c+細(xì)胞可通過調(diào)節(jié)防護(hù)性漿細(xì)胞樣DCs、增加瘧疾特異性抗體從而發(fā)揮對實(shí)驗(yàn)性腦瘧潛在的保護(hù)作用[29]。Hirako IC等發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)性腦瘧模型中脾源性單核細(xì)胞分化后CCR5+ CXCL9/10+ 單核細(xì)胞源樹突狀細(xì)胞以CCR2依賴途徑途徑、CD8+ T淋巴細(xì)胞以CCR5依賴途徑大量進(jìn)入腦組織最終導(dǎo)致腦型瘧致命性神經(jīng)病理綜合癥[30]。

2.2 淋巴細(xì)胞 在瘧疾感染早期，CD4+ 和 CD8+ T 細(xì)胞在抗原提呈細(xì)胞作用下激活，啟動(dòng)抗瘧保護(hù)性細(xì)胞免疫應(yīng)答。Th1 型細(xì)胞免疫應(yīng)答可局限紅內(nèi)期瘧原蟲的爆發(fā)性增殖反應(yīng)，Th2 型細(xì)胞因子輔助 B 細(xì)胞分泌瘧原蟲特異性抗體，實(shí)現(xiàn)對瘧原蟲的最終清除。Th1和 Th2 型免疫應(yīng)答的調(diào)控對清除瘧原蟲、局限相關(guān)病理性損傷有重要意義。T細(xì)胞被趨化至大腦血管周圍是腦型瘧的突出特征之一，其中CD8+T細(xì)胞活化最為明顯。有數(shù)據(jù)顯示，雖活化T細(xì)胞與表達(dá)CX3CR1的抗原呈遞細(xì)胞間存在直接相互作用，但在實(shí)驗(yàn)性腦型瘧中并非決定性因素，而與表達(dá)CD31的凋亡細(xì)胞共定位的致病性CD8+T細(xì)胞可能在實(shí)驗(yàn)性腦型瘧發(fā)展中發(fā)揮重要作用[31，32]。CD4+ CD25+ Foxp3+調(diào)節(jié)型T細(xì)胞（CD4+ CD25+ Foxp3+ Regulatory T Cells，nTreg）可維持前炎癥性免疫應(yīng)答和免疫病理損傷之間的平衡，Blanc A L等發(fā)現(xiàn)nTreg過繼轉(zhuǎn)移可加速實(shí)驗(yàn)性腦型瘧的發(fā)病并影響病變程度，但對寄生蟲血癥并無影響，而初始CD4+T細(xì)胞過繼轉(zhuǎn)移可以預(yù)防實(shí)驗(yàn)性腦型瘧，并促進(jìn)寄生蟲清除。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，在感染早期，nTreg僅在脾臟中擴(kuò)增但并未遷移到神經(jīng)炎癥部位，表明腦型瘧早期nTreg主要通過影響初始CD4+T細(xì)胞免疫應(yīng)答發(fā)揮作用，nTreg可能是調(diào)控腦型瘧免疫反應(yīng)的早期靶標(biāo)之一[33]。Subramaniamendprint

K S等進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，T細(xì)胞活化負(fù)性調(diào)控因子BTNL2基因敲除小鼠感染PbA后存活率顯著降低，并證實(shí)BTNL2在輕度惡性瘧原蟲感染及實(shí)驗(yàn)性腦瘧宿主的免疫調(diào)控中均發(fā)揮重要作用[34]。此外，腦型瘧病理過程與強(qiáng)烈的促炎反應(yīng)和膠質(zhì)細(xì)胞的活化有關(guān)，在PbA感染小鼠釋放的調(diào)節(jié)性介質(zhì)血紅素可通過影響星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活進(jìn)而抑制CD4+和CD8+ T淋巴細(xì)胞在腦中的病理性遷移，并可抑制小膠質(zhì)細(xì)胞極化為M1表型，降低炎性因子在腦內(nèi)表達(dá)水平[35]。

2.3 單核細(xì)胞 先天免疫細(xì)胞表達(dá)特異性活化標(biāo)記物是腦型瘧炎癥反應(yīng)的特征之一。Schumak B認(rèn)為Ly6C+單核細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)性腦瘧炎性過程有實(shí)質(zhì)性作用，以CCR2特異性單克隆抗體耗竭Ly6Chi炎性單核細(xì)胞，或以Gr1特異性單克隆抗體同時(shí)耗竭Ly6Chi炎性單核細(xì)胞和Ly6G+嗜中性粒細(xì)胞可明顯減輕卵白蛋白轉(zhuǎn)基因PbA感染（Ovalbumin-transgenic PbA parasites，PbTg）小鼠實(shí)驗(yàn)性腦瘧發(fā)展，同時(shí)發(fā)現(xiàn)CCR2單克隆抗體注射并未阻斷小鼠大腦周邊PbTg特異性T細(xì)胞應(yīng)答，而Gr1單克隆抗體注射則顯著地減少腦中T細(xì)胞浸潤和CTL反應(yīng)，證實(shí)Ly6Chi炎性單核細(xì)胞在減輕大腦炎癥和中樞系統(tǒng)免疫細(xì)胞募集、阻止實(shí)驗(yàn)性腦瘧免疫病理損傷中扮演重要的角色[36]。新近臨床研究發(fā)現(xiàn)，馬拉維兒童腦瘧、嚴(yán)重瘧疾性貧血兒童單核細(xì)胞CD11、CD18等β2整合素，人類白細(xì)胞DR抗原（human leukocyte antigen DR，HLA-DR）和CD86等粘附分子和活化標(biāo)志物的表達(dá)減少，單核細(xì)胞分泌的炎性細(xì)胞因子TNF-α和IL-6顯著低于健康對照組，表明腦型瘧、重癥瘧疾貧血患兒免疫受抑現(xiàn)象明顯[37]，為臨床有效干預(yù)提供新的線索。

2.4 內(nèi)皮細(xì)胞 瘧原蟲感染后引發(fā)的腦微血管內(nèi)皮功能障礙、血腦屏障破壞及神經(jīng)炎癥等一系列病理過程是腦型瘧的典型特征。血管內(nèi)皮細(xì)胞蛋白C受體（endothelial cell protein C receptor，EPCR）是蛋白C系統(tǒng)的一名新成員，主要由血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌，是反映血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的重要指標(biāo)之一。Moxon C A等在非洲馬拉維地區(qū)腦型瘧兒童尸檢中發(fā)現(xiàn)腦部纖維蛋白凝塊處可見EPCR缺失、感染瘧原蟲紅細(xì)胞局部滯留。提示瘧原蟲滯留區(qū)域中EPCR與兒童腦型瘧凝血、炎癥存在一定的關(guān)聯(lián)性[38]。Pal P等認(rèn)為人腦型瘧感染瘧原蟲紅細(xì)胞導(dǎo)致的大腦微血管內(nèi)皮屏障破壞取決于富含組氨酸蛋白 Ⅱ（histidine-richproteinⅡ，HRPⅡ）的表達(dá)，純化的重組或天然HRPⅡ蛋白可通過促進(jìn)炎性小體形成，導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接完整性降低、通透性增加，促進(jìn)腦型瘧的發(fā)生，提示HRPⅡ可能成為從炎癥角度治療或干預(yù)腦型瘧新的切入點(diǎn)[39]。血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）在保持血管完整性方面發(fā)揮重要作用。腦型瘧患者中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá) VEGF 的星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目增多，反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞通過VEGF-A和胸苷磷酸化酶（thymidine phosphorylase，TYMP）相互作用，抑制腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接蛋白，最終導(dǎo)致血腦屏障破壞[40]。在PbA感染C57BL/6 和 BALB/c 腦瘧模型中均發(fā)現(xiàn)VEGFR 抑制物阿西替尼可加重小鼠腦部病理改變和感染狀況。給予 VEGF 和非致死劑量脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）協(xié)同治療后，小鼠存活率明顯延長，核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2和血紅素單加氧酶（heme oxygenase-1，HO-1）表達(dá)升高，IFN-γ和 TNF-α基因表達(dá)下降[41]，對實(shí)驗(yàn)性腦瘧模型具有保護(hù)作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，洛伐他汀與VEGF聯(lián)合治療能夠通過激活Nrf-2引起抗炎反應(yīng)，減輕PbA誘導(dǎo)內(nèi)皮損傷及系統(tǒng)性炎癥，有效防治實(shí)驗(yàn)性腦瘧[42]，較之VEGF 和LPS聯(lián)合療法更符合倫理學(xué)要求。

2.5 其他 補(bǔ)體系統(tǒng)是瘧疾先天免疫反應(yīng)的重要組成部分，其異常活化可攻擊自體組織，導(dǎo)致不可逆損傷。烏干達(dá)地區(qū)腦型瘧患兒血清C5a含量明顯高于單純瘧疾患者，表明人腦型瘧中存在C5a失調(diào)，通過C5aR依賴性炎癥和內(nèi)皮功能障礙可促進(jìn)腦型瘧的發(fā)生。與野生型小鼠相比，感染PbA的C5aR基因敲除小鼠生存期顯著延長，促炎細(xì)胞因子、血管生成素-2和可溶性ICAM-1分泌降低，而血管生成素-1水平升高，內(nèi)皮完整性降低[43]。

人類C1抑制劑（human C1-inhibitor，C1INH）是一種調(diào)節(jié)凝血、血管通透性和炎癥的多功能蛋白酶抑制劑，Mejia P等研究發(fā)現(xiàn)人類C1INH可通過2種不同的機(jī)制阻斷重癥瘧致病過程。首先，C1INH結(jié)合到寄生蟲表面的惡性瘧原蟲糖基磷脂酰肌醇（PfGPI）分子內(nèi)的聚糖部分，在實(shí)驗(yàn)性腦型瘧模型中可減少寄生蟲血癥，體外實(shí)驗(yàn)中可抑制寄生蟲侵襲紅細(xì)胞及促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生。其二，C1INH在體外可綁定CD36和硫酸軟骨素A分子，通過競爭性結(jié)合干擾感染紅細(xì)胞黏附和在特定組織中的蓄積，降低罹患腦型瘧的風(fēng)險(xiǎn)，提示C1INH可能是腦型瘧治療潛在的靶標(biāo)分子[44]。此外，非洲藥用植物Biophytum umbraculum Welw.對實(shí)驗(yàn)性腦瘧有確切的保護(hù)作用，其抗瘧活性與抑制補(bǔ)體激活、影響巨噬細(xì)胞活化有關(guān)，有望成為腦型瘧新的輔助治療藥物[45]。

3 調(diào)控因子在腦型瘧發(fā)生中的作用

干擾素調(diào)節(jié)因子8（interferon regulatory factor 8，IRF8）是造血細(xì)胞中表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控一系列轉(zhuǎn)錄因子的功能和表觀遺傳改變。IRF8可調(diào)節(jié)單核細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞和嗜堿粒細(xì)胞的形成。IRF8基因敲除小鼠單核吞噬細(xì)胞祖細(xì)胞不能分化成吞噬細(xì)胞，反而異常引起中性粒細(xì)胞產(chǎn)生。IRF8基因敲除小鼠及IRF8表達(dá)缺失或突變的人都會(huì)表現(xiàn)出免疫缺陷[46]。Berghout J 等發(fā)現(xiàn)IRF8調(diào)控基因與急性神經(jīng)炎癥的病理過程有關(guān)，這條特異性的通路包括干擾素誘導(dǎo)、抗原表達(dá)和Th1型細(xì)胞因子分泌等，IRF8在其中充當(dāng)轉(zhuǎn)錄激活因子作用。IRF8等位基因突變或IRF8，IRF1下游靶基因失活對鼠感染PbA所致實(shí)驗(yàn)性腦瘧有保護(hù)作用，提示腦型瘧中感染引起的基因表達(dá)增加與IRF8結(jié)合位點(diǎn)密切相關(guān)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)性腦瘧和肺結(jié)核感染小鼠中IRF8調(diào)控基因有很大的重疊性，此調(diào)控網(wǎng)絡(luò)可能是宿主炎性反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)共同的核心通絡(luò)之一[47-48]。endprint

MicroRNA（miRNA）參與轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控。miR-155已被證明可調(diào)節(jié)瘧原蟲等頂復(fù)門寄生蟲宿主免疫反應(yīng)。有報(bào)道稱大腦內(nèi)皮細(xì)胞miR-155在實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎、LPS致系統(tǒng)性炎癥過程中血腦屏障完整性和T細(xì)胞功能調(diào)節(jié)方面發(fā)揮負(fù)性調(diào)控作用。與野生型小鼠相比，miR-155基因敲除可顯著提高實(shí)驗(yàn)性腦型瘧小鼠生存率和血腦屏障完整性、減少內(nèi)皮細(xì)胞激活，降低微血管通透性，且此作用與Ang/Tie2 系統(tǒng)有關(guān)。提示抑制miR-155的功能可改善腦型瘧癥狀，miR-155或可成為一個(gè)腦型瘧治療干預(yù)的潛在的輔助治療靶標(biāo)[49]。

細(xì)胞因子信號抑制因子2（suppressor of cytokine signaling 2，SOCS2））是由細(xì)胞因子和激素誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)蛋白，可調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答、神經(jīng)營養(yǎng)與發(fā)育、神經(jīng)發(fā)生等。與野生型小鼠相比，實(shí)驗(yàn)性腦型瘧模型PbA感染早期SOCS2基因敲除可顯著降低寄生蟲血癥，減少腦組織中TNF-α，TGF-β，IL-12和IL-17，但在感染后期SOCS2基因敲除小鼠則有加重寄生蟲血癥傾向，同時(shí)Treg細(xì)胞浸潤減少，腦中相關(guān)細(xì)胞因子水平升高，而保護(hù)性神經(jīng)營養(yǎng)因子如神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞系衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子（glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF）和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）顯著降低，同時(shí)可見焦慮相關(guān)行為和認(rèn)知障礙，其機(jī)制與一氧化氮（nitric oxide，NO）產(chǎn)物增加有關(guān)。提示SOCS2在PbA感染過程中起著雙重作用，在調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答和神經(jīng)營養(yǎng)因子產(chǎn)生方面可能發(fā)揮至關(guān)重要的作用[50]。

此外，Muoz-Ruiz M等的最新研究發(fā)現(xiàn)，CD3雙單倍體缺陷小鼠（CD3DH））可見促炎γδT細(xì)胞亞群T細(xì)胞抗原受體（T cell antigen receptor，TCR）表達(dá)及信號強(qiáng)度降低，成年CD3DH小鼠顯示出較強(qiáng)的抗實(shí)驗(yàn)性腦型瘧作用，主要與外周血促炎IFN-γ+γδT細(xì)胞減少及影響后續(xù)生理病理過程有關(guān)[51]。

4 腦型瘧炎癥及免疫相關(guān)生物標(biāo)記物

腦型瘧發(fā)生發(fā)展的復(fù)雜性特征決定了其早期診斷、風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測很難有高度敏感、特異的生物標(biāo)記物。2011年Erdman曾報(bào)道多個(gè)宿主炎癥和內(nèi)皮細(xì)胞激活的標(biāo)志物相結(jié)合可準(zhǔn)確預(yù)測重癥瘧疾兒童的死亡率。Lucchi N W等支持上述觀點(diǎn)，也認(rèn)為單一的生物標(biāo)志物對腦型瘧并不可靠，證實(shí)包括CXCL10，CXCL4，Ang-2/Ang-1，VEGF（vascular endothelial growth factor），EPO（erythropoietin），sTNFR2（soluble tumor necrosis factor receptor 2）在內(nèi)的復(fù)合指標(biāo)群可作為預(yù)測腦型瘧發(fā)生危險(xiǎn)的潛在生物標(biāo)記物[52]。

高濃度HRP2是惡性瘧原蟲紅內(nèi)期保護(hù)性抗原，也是重要的疫苗候選抗原。HRP-Ⅱ被認(rèn)為可準(zhǔn)確預(yù)測包括腦型瘧在內(nèi)的重癥瘧預(yù)后和死亡風(fēng)險(xiǎn)[53-54]，且HRP2濃度升高同時(shí)伴有兒童視網(wǎng)膜病變者可作為判斷腦型瘧昏迷的直接依據(jù)，為臨床快速、準(zhǔn)確區(qū)分腦型瘧昏迷與其他感染昏迷、提高腦型瘧救治率提供有效方法[55]。Mariotti Ferrandiz E等采用高通量CDR3光譜法從腦型瘧小鼠脾臟和血液中發(fā)現(xiàn)一種特異性TCRβ，可作為腦型瘧預(yù)測、診斷和預(yù)后的新方法[56]。此外，一項(xiàng)在塞內(nèi)加爾地區(qū)進(jìn)行的臨床研究發(fā)現(xiàn)，基于對受感染紅細(xì)胞5種抗原的IgG應(yīng)答和結(jié)合反應(yīng)可準(zhǔn)確識(shí)別腦型瘧，為瘧疾分型、相關(guān)功能測定及對癥治療提供新線索[57]。

5 基于炎癥及免疫干預(yù)的腦型瘧治療藥物

迄今為止，腦型瘧仍是非洲兒童死亡的主要原因之一，近年來針對腦型瘧輔助治療藥物研究探索始終是一個(gè)熱點(diǎn)。

青蒿琥酯被認(rèn)為是治療嚴(yán)重瘧疾最有效的藥物。靜脈注射青蒿琥酯是WHO推薦的腦型瘧首選治療方案，作為目前一線治療藥物，雖與奎寧相比已顯著降低腦型瘧的臨床風(fēng)險(xiǎn)，但仍不足以完全控制腦型瘧的兇險(xiǎn)病程。除抗瘧活性外，青蒿琥酯具有抗炎作用[58-59]，有研究證實(shí)其對實(shí)驗(yàn)性腦型瘧的保護(hù)作用與其抗炎作用有關(guān)，能顯著降低實(shí)驗(yàn)性腦型瘧模型死亡率，迅速降低腦組織中白細(xì)胞浸潤和模型小鼠海馬和額葉皮質(zhì)中炎性細(xì)胞因子表達(dá)，并改善小鼠神經(jīng)損傷[60-61]。同時(shí)，靜脈注射是青蒿琥酯治療重癥瘧疾的主要給藥方法，但在非洲腦型瘧高發(fā)地區(qū)，惡劣醫(yī)療條件在很大程度上限制了青蒿琥酯的臨床應(yīng)用。Marijon A等發(fā)現(xiàn)，青蒿琥酯經(jīng)鼻給藥15min后小鼠血液和大腦組織中可檢測出雙氫青蒿素，給藥后24 h原蟲血癥下降88.7%，腦型瘧疾的癥狀明顯改善，并大大降低了死亡率，經(jīng)鼻給藥可能成為青蒿琥酯治療腦型瘧新的給藥途徑[62]。雙氫青蒿素與NO供體furoxan復(fù)合體在體外和體內(nèi)均顯示出與青蒿琥酯和蒿甲醚相當(dāng)抗瘧活性，并可使實(shí)驗(yàn)性腦型瘧小鼠生存期顯著延長[63]，山竹果皮提取物在體外實(shí)驗(yàn)中對青蒿素的抗瘧活性有協(xié)同增效作用[64]。

免疫平衡失調(diào)導(dǎo)致的神經(jīng)炎癥是腦型瘧的核心機(jī)制之一。Hasegawa C等報(bào)道，類固醇對臨床腦型瘧患者出現(xiàn)的持續(xù)昏迷、彌漫性腦白質(zhì)病變、神經(jīng)異常癥狀延長等有良好的療效[65]。神經(jīng)炎癥反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)劑大麻二酚及其受體對實(shí)驗(yàn)性腦瘧小鼠有明確的保護(hù)作用，大麻二酚可增加模型小鼠海馬腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子表達(dá)，減少海馬TNF-α和前額葉皮層IL-6等促炎細(xì)胞因子水平[66]。與野生型小鼠比較，大麻素受體2編碼基因Cnr2缺失的實(shí)驗(yàn)性腦瘧小鼠存活率顯著增高，血腦屏障破壞減輕，特異性大麻素受體2拮抗劑也顯示出同樣的療效，且其作用有M2巨噬細(xì)胞趨化因子CCL17依賴趨勢，提示大麻素受體 2靶向治療可能成為腦型瘧替代治療方案[67]。

研究發(fā)現(xiàn)VD口服給藥可顯著抑制PbA感染實(shí)驗(yàn)性腦型瘧小鼠血清細(xì)胞因子IFN-γ和TNF-α分泌及全身炎癥反應(yīng)，降低腦組織中趨化因子、細(xì)胞粘附分子表達(dá)，改善血腦屏障完整性，抑制脾臟樹突狀細(xì)胞分化、激活、成熟及細(xì)胞因子表達(dá)，提示VD可通過抑制宿主炎性應(yīng)答發(fā)揮對實(shí)驗(yàn)性腦瘧模型小鼠的保護(hù)作用[68]。已有研究報(bào)道右旋糖酐鐵可明顯降低實(shí)驗(yàn)性腦瘧發(fā)生率，腦組織中CD4+和CD8+T細(xì)胞顯著減少，CD4+T細(xì)胞CXCR3表達(dá)和IFN-γ反應(yīng)性降低，同時(shí)對脾細(xì)胞亞群NK細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞均有調(diào)節(jié)作用，提示右旋糖酐鐵能夠通過減輕T細(xì)胞向腦內(nèi)遷移抑制腦型瘧的病理過程[69]。此外，免疫抑制劑他克莫司[70]、膜穩(wěn)定劑胞二磷膽堿[71]、血管緊張素Ⅱ[72]均證實(shí)在體外可抑制惡性瘧原蟲生長，體內(nèi)對實(shí)驗(yàn)性腦型瘧小鼠有明確的保護(hù)作用，成為頗具前景的腦型瘧輔助治療方案。endprint